李 敏，楊君君，楊 靜，王躍飛，柴 欣

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的果實，是中國傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛。補骨脂具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，內(nèi)用治療腰膝冷痛、滑精、遺尿、虛寒咳嗽，外用治療白癜風(fēng)[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補骨脂具有增加心肌收縮力、增強免疫[2]、擴張血管、抗菌[3-4]、抗炎[5-6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、雌激素樣等作用[10-11]。生補骨脂由果皮和種子構(gòu)成，果皮中含有壁內(nèi)腺、維管束等；種子由種皮、子葉、胚等組成，具體結(jié)構(gòu)見圖1[12]。文獻報道補骨脂中含有100多種化合物，主要包括香豆素、黃酮、單萜酚類化合物[13-15]。

中藥安全性問題日益引起人們的關(guān)注，關(guān)系中醫(yī)藥的健康持續(xù)發(fā)展[16]。隨著補骨脂的臨床應(yīng)用不斷擴大，其肝臟毒性問題也倍受關(guān)注。周昆等研究表明補骨脂水提取液具有肝毒性，且水提液中主要成分為補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素和異補骨脂素[17]；Cheung等報道了補骨脂中相關(guān)化學(xué)成分可導(dǎo)致肝臟毒性[18]。補骨脂苷和異補骨脂苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為補骨脂素和異補骨脂素，導(dǎo)致補骨脂素和異補骨脂素的大量吸收，可能是導(dǎo)致肝臟毒性的原因[19]。

圖1 補骨脂橫切面簡圖Fig.1 Cross-section diagram of Fructus Psoralea

本研究采用超高效液相色譜法系統(tǒng)研究補骨脂香豆素、黃酮、單萜酚等化學(xué)成分在果皮和種子中的分布情況，以期闡明其化合物的分布規(guī)律，為補骨脂的成分研究、加工炮制工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLCsystem（美國沃特世公司），XS205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SCIENTZSB 25-12DTN型超聲波清洗器（寧波新芝生物有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz），TGL-16C 型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品及試劑 補骨脂素（批號110738-201313）、異補骨脂素（批號 110739-201115）均購自中國食品藥品檢定研究院；補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂香豆雌烷 B、補骨脂定、4″，5″-去氫異補骨脂定、補骨脂甲素、補骨脂乙素、新補骨脂異黃酮、巴庫查爾酮、補骨脂寧、Corylifol A、Corylifol C、補骨脂查爾酮、補骨脂酚均為實驗室自制[NMR、MS鑒定化合物結(jié)構(gòu)，超高效液相色譜-紫外法（UPLC-UV）分析純度≥98%]。甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

生補骨脂：由天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，產(chǎn)地分別為廣西（GX）、河北 1（HB 1）、河北2（HB 2）、河南（HN）。

生補骨脂果皮、種子：取生補骨脂藥材，用刀片將果皮和種子剝離，備用。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）溶液，梯度洗脫（0～20 min，10%→74%A；20～25min，74%→90%A）；柱溫 60℃；流速 0.3mL/min；檢測波長：246 nm；進樣量：2μL。

表1 生補骨脂果皮和種子的質(zhì)量Tab.1 Mass of pericarp and seed of Fructus Psoralea

2.2 對照品溶液制備 分別取補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂香豆雌烷B、Corylifol C、巴庫查爾酮、補骨脂甲素、新補骨脂異黃酮、補骨脂寧、補骨脂乙素、補骨脂定、4″，5″-去氫異補骨脂定、Corylifol A、補骨脂查爾酮、補骨脂酚標(biāo)準品適量，精密稱定，制成質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL的對照品儲備液，備用。

分別取上述對照品儲備液適量，混勻，得對照品工作液，其濃度為補骨脂苷40.80μg/mL、異補骨脂苷41.20μg/mL、補骨脂素106.00μg/mL、異補骨脂素104.00μg/mL、補骨脂香豆雌烷B 40.83μg/mL、Corylifol C46.67μg/mL、巴庫查爾酮 42.92μg/mL、補骨脂甲素42.08μg/mL、新補骨脂異黃酮41.25μg/mL、補骨脂寧50.42μg/mL、補骨脂乙素47.08μg/mL、補骨脂定 45.00 μg/mL、4″，5″-去氫異補骨脂定43.33μg/mL、Corylifol A 44.17μg/mL、補骨脂查爾酮42.08μg/mL、補骨脂酚41.67μg/mL。

2.3 供試品溶液制備 取果皮，粉碎，取粉末0.3 g，精密稱定，置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇，密塞，60℃超聲處理（功率300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加1 mL 30%甲醇水溶液，搖勻，即得果皮供試品溶液，備用。

取種子，粉碎，取粉末0.25 g，精密稱定，置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇，密塞，60℃超聲處理（功率 300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加1 mL 30%甲醇水溶液，搖勻，即得種子供試品溶液，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 補骨脂果皮和種子質(zhì)量分布情況 取4批生補骨脂藥材，按“1.2”項下方法處理生補骨脂，分離生補骨脂果皮和種子，分別稱取質(zhì)量，結(jié)果見表1。

由表1可知，產(chǎn)地分別為廣西、河北、河南的生補骨脂，種子占生補骨脂總質(zhì)量的54.29%～66.67%；果皮占生補骨脂總質(zhì)量的33.33%～45.71%。

3.2 補骨脂果皮和種子中化合物分布規(guī)律研究 取生補骨脂果皮、種子，按“2.3”項下供試品制備方法制備果皮、種子供試品溶液，每種樣品稱取2份，按“2.1”項下方法分析供試品溶及對照品溶液中主要成分，每份樣品平行進樣2次，色譜圖見圖2。

為了獲得生補骨脂中化合物分布情況，分別讀取果皮和種子供試品溶液中各化合物的峰面積，按照下式計算生補骨脂果皮和種子中化合物的相對含量，分別標(biāo)記為Pi%和Pi′%，計算公式如下：

其中，i代表化合物，Pi%為化合物i在果皮中的量占該化合物總量的百分比；M為生補骨脂的果皮質(zhì)量；M′為生補骨脂的種子質(zhì)量；A為果皮供試品溶液中化合物i的峰面積；A′為種子供試品溶液中化合物i的峰面積；m為制備果皮供試品溶液時的果皮粉末取樣量；m′為制備種子供試品溶液時的種子粉末取樣量。Pi′%為化合物i在種子中的量占該化合物總量的百分比。計算結(jié)果見表2。

由表2可知，生補骨脂種子中主要含有補骨脂苷、異補骨脂苷，分別占生補骨脂果實中補骨脂苷、異補骨脂苷總量的89.63%以上；補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂定、4″，5″-去氫異補骨脂定分別占其總量的16.67%～63.39%；含有少量黃酮和單萜酚類化合物。果皮中主要含有黃酮和單萜酚類化合物，果皮中Corylifol C、巴庫查爾酮、補骨脂甲素、補骨脂寧、補骨脂酚等黃酮和單萜酚類化合物分別占其總量的80.86%以上；補骨脂苷、異補骨脂苷分別占其總量的10.37%以下，補骨脂素、異補骨脂素占其總量的36.61%～76.87%，補骨脂香豆雌烷B占其總量的63.33%，補骨脂定和4″，5″-去氫異補骨脂定占其總量的42.55%～83.33%。

圖2 對照品溶液（A）、補骨脂果皮（B）、種子（C）供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of the standard solution(A)and sample solution of pericarp(B)and seed(C)of Fructus Psoralea

表2 生補骨脂果皮和種子中化合物的分布情況Tab.2 Distribution of compounds in pericarp and seed of Fructus Psoralea %

生補骨脂中補骨脂苷、異補骨脂苷主要存在于生補骨脂的種子中，而黃酮、單萜酚、脂溶性香豆素主要存在于生補骨脂的果皮中，因此可以通過分離補骨脂果皮和種子快速富集補骨脂中化學(xué)成分。此外，除去種子可去除大量補骨脂苷、異補骨脂苷，大幅減少提取物中補骨脂苷、異補骨脂苷的含量，從而減少補骨脂苷、異補骨脂苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為補骨脂素、異補骨脂素[19]，降低肝臟毒性風(fēng)險。

4 結(jié)論

本實驗采用超高效液相色譜法測定生補骨脂果皮、種子中化合物相對含量，闡釋香豆素、黃酮、單萜酚在果皮和種子中分布規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)補骨脂苷和異補骨脂苷主要存在于種子中，黃酮和單萜酚類化合物主要存在于果皮中，脂溶性香豆素類成分在果皮和種子中均有分布。