劉 琦 祝 霞 趙丹丹 王璐璐 韓舜愈 楊學(xué)山

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;3 甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

品種香氣決定了葡萄酒的特點(diǎn)和典型性[1],構(gòu)成品種香氣的物質(zhì)主要包括萜烯類化合物、降異戊二烯等。其中,單萜化合物感官閾值較低,具有濃郁的花香、果香味[2-3],如芳樟醇具有輕微的柑橘味和淡淡的玫瑰花香,α-萜品醇具有類似紫丁香花香、百合花香,香茅醇具有檸檬和柑橘香,香葉醇具有玫瑰花香,且它們的感官閾值在18～400 μg·L-1,遠(yuǎn)低于葡萄酒中其他香氣物質(zhì),是葡萄酒品種香氣最主要的貢獻(xiàn)者[4-5]。早期研究認(rèn)為,葡萄酒中的單萜化合物主要來自釀酒葡萄原料本身,而主導(dǎo)葡萄酒發(fā)酵的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞內(nèi)不存在單萜合成酶,不能合成單萜化合物[6-7]。但Camesasca 等[8]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母BY4743 菌株可在不含單萜前體物質(zhì)的模擬葡萄汁中從頭合成單萜化合物。此外,Carrau 等[9]將釀酒酵母菌株M522 接種到化學(xué)合成的模擬葡萄汁中,發(fā)酵結(jié)束后在其發(fā)酵液中檢出了葡萄酒中常見的芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇等4種單萜化合物,且適當(dāng)增加模擬汁中可同化氮含量以及減少發(fā)酵過程中通氧量均有利于單萜物質(zhì)的積累。但釀酒酵母產(chǎn)生的單萜化合物含量較少[8-9],因此,建立準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性高的單萜物質(zhì)檢測方法將有助于進(jìn)一步深入研究其代謝機(jī)制。

氣相色譜(gas chromatography,GC)具有操作簡單、儀器價格和樣品檢測費(fèi)用較低以及易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于葡萄酒香氣分析領(lǐng)域[10]。通常在氣相色譜分析之前需對樣品中的香氣物質(zhì)進(jìn)行富集處理,以滿足分析檢測,目前主要使用的香氣富集方法有頂空固相微萃取 (headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)[11]、低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑的液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)[12]、固相微萃取[13]等。LLE 主要利用“相似相溶”原理對香氣物質(zhì)進(jìn)行富集濃縮,由于單萜化合物在有機(jī)相中的分配系數(shù)較高,因而可用于單萜化合物的萃取研究。Andujar-Ortiz 等[14]結(jié)合氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)技術(shù),比較了LLE、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)以及HS-SPME 3種前處理方法在葡萄酒香氣物質(zhì)檢測中的效果,結(jié)果表明,LLE 顯現(xiàn)出良好的線性與重復(fù)性,萃取效果較好。然而,LLE 也存在一些弊端,如使用有機(jī)溶劑量大、操作步驟繁瑣且耗時長等[15]。目前,超聲波在分離提取研究中應(yīng)用較多,主要是利用超聲波產(chǎn)生的“空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、強(qiáng)化擴(kuò)散”等多種效應(yīng)增強(qiáng)萃取過程中的傳質(zhì)作用,增大待分離物質(zhì)分子運(yùn)動頻率和速度,使目標(biāo)成分更容易進(jìn)入溶劑,從而提高萃取效率[16-17]。羅靜等[18]利用超聲輔助處理提取鮮桃果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì),Porto 等[19]比較單純浸漬與超聲輔助法提取大麻中揮發(fā)性萜類化合物,Li 等[20]利用超聲輔助法提取葡萄果皮中花青素,上述研究均表明,超聲輔助提取能明顯提高目標(biāo)成分的提取含量,大大縮短提取時間。但目前超聲波輔助提取技術(shù)在葡萄酒香氣富集前處理中應(yīng)用較少。

在葡萄酒發(fā)酵過程中,葡萄果實(shí)中的單萜化合物前體物質(zhì)會被釀酒酵母菌株產(chǎn)生的β-糖苷酶水解釋放,會對釀酒酵母菌株合成單萜化合物的檢測產(chǎn)生影響。故本試驗(yàn)擬采用無糖苷前體的模擬葡萄汁體系,通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助LLE的香氣檢測前處理工藝,并結(jié)合GC 外標(biāo)定量法,建立一種相對準(zhǔn)確、高效、可同時檢測多種單萜化合物的方法,探討釀酒酵母菌株從頭合成單萜化合物的能力,旨在為深入研究釀酒酵母菌株單萜化合物合成機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

釀酒酵母菌株LA-FR,購自上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司。

1.2 試劑與儀器

主要試劑:芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇標(biāo)準(zhǔn)品,均購自美國Sigma公司;二氯甲烷,國產(chǎn)色譜純;NaCl為國產(chǎn)分析純。

主要儀器:PHS-3C pH 計(jì),上海雷磁有限責(zé)任公司;PAL-2數(shù)顯手持糖度計(jì),日本愛宕ATAGO公司;L550 臺式低速離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;JY96-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;RE600A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;Clarus500 GC-FID,美國PerkinElmer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模擬葡萄汁的配制 參考劉琦等[21]的方法。碳源:葡萄糖200 g·L-1、纖維二糖0.2 g·L-1;氮源:磷酸氫二銨1.5 g·L-1;酸:酒石酸氫鉀2.5 g·L-1、L-蘋果酸3.0 g·L-1、檸檬酸0.2 g·L-1;礦物質(zhì):磷酸氫二鉀1.14 g·L-1、硫酸鎂1.23 g·L-1,SO2添加量為40 mg·L-1。

1.3.2 釀酒酵母菌株活化與模擬汁發(fā)酵 參考王媛等[22]的方法并略做修改。將釀酒酵母干粉溶于10倍體積無菌水中,37℃靜置溶解20 min,再加入等體積的模擬葡萄汁于28℃活化25 min,按推薦用量(0.2 g·L-1)將活化好的釀酒酵母菌株接種到模擬葡萄汁中,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d,待發(fā)酵結(jié)束后取模擬酒樣離心(4 000 r·min-1、15 min),取上清液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 氣相色譜- 氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-hydrogen flame ionization detector,GCFID)分析條件 參考李艷等[10]的方法并略作修改。色譜柱為DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氮?dú)?流速2 mL·min-1;升溫程序:初始溫度為40℃,保持5 min,以15℃·min-1升溫至180℃,保持1 min,以15℃·min-1升溫至230℃,保持1 min;1 μL 樣品分流進(jìn)樣,分流比為5 ∶1;進(jìn)樣口溫度:250℃;檢測溫度:280℃;尾吹:25 mL·min-1;氫氣流量:45 mL·min-1,空氣流量:450 mL·min-1。

1.3.4 單萜化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以二氯甲烷為溶劑配制不同種類單萜化合物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,先配制濃度為5 μL·mL-1的母液,再將其用二氯甲烷分別稀釋2、10、20、100、200和1 000倍,利用GC-FID 測定相應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 單萜化合物含量計(jì)算 根據(jù)GC-FID所測模擬酒樣品中芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、香葉醇4種單萜物質(zhì)的峰面積,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到測定樣品中各單萜化合物的含量,并以樣品中檢出的單萜化合物的總量作為考查指標(biāo)進(jìn)行LLE 工藝條件優(yōu)化。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 超聲功率對單萜化合物萃取的影響 取1.3.2 獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲萃取15 min,超聲功率分別為300、400、500、600 W。然后將萃取體系4 000 r·min-1離心10 min,抽提得到上層水相并重復(fù)上述操作進(jìn)行第二次萃取,合并2次萃取后的有機(jī)相,旋蒸(20℃)濃縮至約1 mL,再用二氯甲烷復(fù)溶至3 mL,吸取復(fù)溶液1 μL進(jìn)行氣相色譜分析。試驗(yàn)重復(fù)3次,比較單萜含量,確定較佳超聲功率值。

1.3.6.2 超聲時間對單萜萃取的影響 取1.3.2 獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲萃取,超聲功率400 W,超聲時間分別為5、10、15、20 min。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳超聲時間。

1.3.6.3 NaCl 添加量對單萜萃取的影響 取1.3.2獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷,NaCl的添加量分別為3.0、4.5、6.0、7.5 g,渦旋震蕩5 min,超聲時間15 min,超聲功率400 W。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳NaCl 添加量。

1.3.6.4 萃取劑體積對單萜萃取的影響 取1.3.2獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,分別加入5、10、15、20 mL 二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲時間15 min,超聲功率400 W。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳萃取劑體積。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),以單萜含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4 因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of response surface test

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制圖,用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性分析(Duncan 法,P＜0.05),采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單萜物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2可知,4種單萜化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍滿足檢測要求,且其決定系數(shù)(R2)均在0.996 2～0.999 6 范圍內(nèi),表明線性關(guān)系良好。試驗(yàn)的重復(fù)性用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)來表示,4種單萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的RSD 在6.35%～10.06%范圍內(nèi),表明試驗(yàn)重復(fù)性較好,可用于這4種單萜物質(zhì)的定量分析。

表2 單萜物質(zhì)的GC-FID 分析結(jié)果Table2 GC-FID analysis results of monoterpenes

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 超聲功率對單萜化合物萃取的影響 由圖1-A可知,隨著超聲功率從300 W 增大至600 W,單萜含量呈先增加后減小的趨勢,且超聲功率為400 W時,單萜含量達(dá)到最大,為41.003 μg·L-1。超聲輔助提取主要是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化效應(yīng)促使有效成分進(jìn)入溶劑,但當(dāng)超聲功率過高時可能會破壞有效成分的結(jié)構(gòu),同時可能有其他雜質(zhì)溶入,導(dǎo)致提取效果降低[23-24],因此后續(xù)試驗(yàn)的超聲功率選擇400 W 較適宜。

2.2.2 超聲時間對單萜化合物萃取的影響 由圖1-B可知,隨著超聲時間的延長,單萜含量緩慢上升,當(dāng)超聲時間為15 min時,單萜含量最高,但當(dāng)超聲時間超過15 min時,單萜含量降低,這可能是由于超聲時間過長,超聲過程中產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致溶液溫度升高,增加了單萜物質(zhì)的揮發(fā),從而造成檢出的單萜含量降低,所以后續(xù)試驗(yàn)的超聲時間選擇15 min 較佳。

2.2.3 NaCl 添加量對單萜化合物萃取的影響 在LLE 過程中添加無機(jī)鹽是常見的提高萃取效率的措施,無機(jī)鹽在水相中以水合離子的形式存在,促使水相中微量的香氣物質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相,從而提高萃取效果[25-26]。由圖1-C可知,當(dāng)NaCl 添加量從3.0 g 增加至4.5 g時,單萜含量增加了91.27%,當(dāng)繼續(xù)加大NaCl 添加量,單萜含量變化較小。添加適量的NaCl能明顯提高萃取效果,這主要是由于中性鹽溶于水相后形成的陰陽離子會破壞香氣物質(zhì)在水相中的溶解平衡,降低其在水相中的溶解度,且NaCl 溶于水會增加溶液的極性,促使水相中極性較低的香氣物質(zhì)聚集和釋放[27-28]。當(dāng)添加4.5 g NaCl時,溶液已接近飽和狀態(tài),繼續(xù)添加NaCl 對萃取效率提升較小,因此萃取過程中添加4.5 g NaCl 較為合適。

2.2.4 萃取劑體積對單萜化合物萃取的影響 由圖1-D可知,單萜含量隨萃取劑體積的增加而迅速升高,且當(dāng)二氯甲烷體積為15 mL時單萜含量最高,此時單萜含量為43.15 μg·L-1,當(dāng)二氯甲烷體積超過15 mL時,單萜含量出現(xiàn)略微下降,這可能是由于LLE的步驟較多,且二氯甲烷沸點(diǎn)低、易揮發(fā),隨著萃取劑體積的增加,萃取過程中溶劑損失也隨之增加,導(dǎo)致可檢測出的單萜含量減少,因此選擇二氯甲烷體積為15 mL較為適宜。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of the single factor test

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化LLE 工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化模擬酒樣中單萜化合物的萃取工藝,響應(yīng)面的具體因素水平組合及試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Response surface test design and results

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表3所得結(jié)果進(jìn)行回歸建模分析,并對所得回歸模型做方差分析及顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表4所示,其中交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC的P值均大于0.05,說明它們之間的交互作用不顯著,屬于模型中的冗余參數(shù),因而需對回歸模型進(jìn)一步優(yōu)化?；貧w模型經(jīng)逐步優(yōu)化后得到表5,相比優(yōu)化前的回歸模型,其矯正決定系數(shù)變大,變異系數(shù)變小,表明模型更優(yōu),對試驗(yàn)結(jié)果的擬合度更高。由表5和表6可知,模型通過檢驗(yàn)(P＜0.000 1),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型失擬項(xiàng)不顯著,即試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)可以用模型來解釋。決定系數(shù)R2=0.970 7,矯正決定系數(shù)表明回歸方程對該試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度較高,能解釋試驗(yàn)中97.07%的全部變異進(jìn)一步說明該模型具有良好的可信度,因而可利用該模型進(jìn)行LLE的工藝參數(shù)優(yōu)化。經(jīng)回歸建模分析,最終得到的響應(yīng)面回歸方程為Y= - 356.263 + 1.108A+ 9.361B+21.187C+ 7.010D-0.010AC-0.077BD-0.227CD-0.001A2-0.271B2-1.395C2-0.153D2,由回歸分析結(jié)果可知,4個因素對萃取效率影響的主次順序?yàn)槌暪β剩綨aCl 添加量＞萃取劑體積＞超聲時間。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果 響應(yīng)面分析圖中,顏色從藍(lán)色到紅色變化表示單萜含量從低到高,響應(yīng)面為凸面表示試驗(yàn)指標(biāo)具有最大值,響應(yīng)面坡度越大,即因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著;等高線的形狀可直觀反映因素間交互作用的強(qiáng)弱,橢圓表示因素間交互作用較強(qiáng),接近圓形則表示因素間交互作用較弱[29-30]。圖2-a 沿A 軸方向較陡,沿C 軸方向較為平緩,表明與NaCl 添加量相比,超聲功率對單萜含量影響更大,且在不同NaCl 添加量的條件下,超聲功率變化對單萜含量影響較小,即超聲功率與NaCl 添加量2個因素間的交互作用較弱。由圖2-b可知,隨著超聲時間的延長,單萜含量呈先增大后減小的趨勢,并在15 min 附近具有最大值。當(dāng)萃取劑體積增加到約15 mL時,單萜含量達(dá)到最大值,繼續(xù)增加萃取劑體積,單萜含量變化較小。在不同超聲時間下,萃取劑體積對單萜含量影響較大,即超聲時間和萃取劑體積間的交互作用較強(qiáng)。由圖2-c可知,NaCl 添加量和萃取劑體積對單萜含量影響的趨勢相似,均對單萜含量影響較大,等高線為橢圓,說明二者交互作用明顯,且響應(yīng)圖中所反映的因素間的交互作用與回歸方程的顯著性分析結(jié)果一致。

表6 回歸模型可信度分析Table6 Confidence analysis of regression model

2.3.4 響應(yīng)面工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn) 對回歸方程進(jìn)行最大值求解得到最優(yōu)工藝參數(shù),為了驗(yàn)證回歸模型所確定的最優(yōu)條件的正確性,結(jié)合實(shí)際操作對最優(yōu)參數(shù)略作調(diào)整后進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),驗(yàn)證試驗(yàn)所得單萜含量為44.06 μg·L-1,與理論預(yù)測值相近,誤差較小(表7)。由此可見,該回歸模型所優(yōu)化的工藝參數(shù)具有較高的可行性,可應(yīng)用于實(shí)際萃取。

表7 最優(yōu)工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table7 Optimal process parameters and results of verification tests

3 討論

定性定量分析依舊是葡萄酒香氣研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn),盡管現(xiàn)已開發(fā)出多種新型香氣富集設(shè)備和方法,但各有優(yōu)缺點(diǎn)。LLE 作為一種傳統(tǒng)技術(shù)在揮發(fā)性物質(zhì)萃取中已有廣泛應(yīng)用。牛云蔚等[31]比較了LLE、攪拌棒吸附萃取HS-SPME3種香氣富集方法對櫻桃酒香氣成分的影響,結(jié)果表明,用3種方法萃取后經(jīng)GC-MS 檢出的香氣物質(zhì)差異較大,其中HS-SPEM處理后檢出的香氣物質(zhì)總量最高,LLE處理后檢出的香氣物質(zhì)種類最多。Ivanova 等[32]通過LLE 結(jié)合GC-MS 技術(shù)建立了一種分離和檢測葡萄酒中揮發(fā)性成分的分析方法,利用該方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995 1～0.999 2范圍內(nèi),且樣品檢測RSD＜10%,表明該方法重復(fù)性較好。Cabredo-Pinillos 等[33]在進(jìn)行葡萄酒中揮發(fā)性化合物的提取研究中比較己烷、石油醚、戊烷、二氯甲烷和乙醚5種有機(jī)溶劑的萃取效果,其中二氯甲烷萃取效果最佳。此外,不同溶劑在萃取過程中基質(zhì)效應(yīng)差異較大,對目標(biāo)物質(zhì)分析產(chǎn)生的干擾也明顯不同,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[34]。二氯甲烷與單萜化合物極性相似,萃取過程中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)較弱,當(dāng)選用乙醇、丙酮、石油醚等溶劑萃取時,基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng),導(dǎo)致萃取效果不佳,因此本研究選擇二氯甲烷作為單萜化合物的萃取劑。

圖2 各因素間交互作用對單萜含量影響的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of interaction between various factors on monoterpene content

前人研究表明,葡萄酒中的單萜化合物絕大部分來自葡萄果實(shí)中以糖苷態(tài)形式存在的單萜前體物質(zhì),在發(fā)酵過程中經(jīng)釀酒酵母產(chǎn)生的糖苷酶將其水解并釋放[1,35]。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道,葡萄酒中的單萜化合物并非只來自葡萄原料本身,酵母細(xì)胞也可能合成少量單萜化合物。早前有學(xué)者指出,僅有幾種非釀酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)可以合成微量單萜化合物,如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、檸檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)等[9]。原苗苗等[36]在模擬葡萄汁中比較了3株非釀酒酵母的產(chǎn)香特性,在其發(fā)酵液中共檢測出7種單萜化合物,表明非釀酒酵母確實(shí)能從頭合成單萜化合物,且不同非釀酒酵母合成單萜化合物的能力也有差異,其中淺白隱球酵母產(chǎn)單萜能力最強(qiáng),在其發(fā)酵液中共檢測到0.70 mg·L-1的單萜化合物;此研究選用的對照菌株為釀酒酵母DV10,在其發(fā)酵液中也檢測到單萜化合物,且單萜物質(zhì)的含量高于3種非釀酒酵母,所以釀酒酵母也可以從頭合成單萜物質(zhì)。在本研究中檢測到44.06 μg·L-1的單萜化合物,進(jìn)一步證實(shí)釀酒酵母菌株可以從頭合成單萜化合物,但釀酒酵母合成單萜化合物的合成途徑與內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。Carrau 等[9]在研究釀酒酵母合成單萜化合物時發(fā)現(xiàn),釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)存在與甲基巴豆酰-CoA 羧化酶(methyl crotonyl-CoA carboxylase,MCC)具有同源性的幾種蛋白序列,該酶是亮氨酸分解代謝以及單萜化合物合成的關(guān)鍵酶,對釀酒酵母蛋白質(zhì)序列進(jìn)行Blast 比對發(fā)現(xiàn),釀酒酵母細(xì)胞中確實(shí)存在與其他物種MCC 同源的蛋白序列,因而推測釀酒酵母合成單萜化合物可能與其細(xì)胞內(nèi)亮氨酸分解代謝有關(guān),但該途徑尚未得到進(jìn)一步證實(shí)。此外,釀酒酵母還具有代謝補(bǔ)充單萜的能力,如香葉醇可在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為香茅醇,香茅醇可轉(zhuǎn)化為芳樟醇,少量香葉醇也可異位成芳樟醇[37-38],還有文獻(xiàn)報(bào)道,芳樟醇可環(huán)化成α-萜品醇,橙花醇可異構(gòu)成香葉醇和α-萜品醇等[39]。因此本研究在模擬葡萄汁中檢出的單萜化合物可能有不同的來源,有些單萜可能是酵母從頭合成,有些單萜可能是其他單萜經(jīng)釀酒酵母生物轉(zhuǎn)化而來,釀酒酵母菌株合成與轉(zhuǎn)化單萜化合物的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚,有待后續(xù)深入探究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用氣相色譜建立了芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇4種單萜化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對模擬酒中單萜化合物的萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到的最優(yōu)萃取工藝參數(shù)為:超聲功率405 W,超聲時間15 min,NaCl 添加量4.9 g,萃取劑體積15.5 mL,在此條件下結(jié)合GC檢測,建立了一種相對高效且準(zhǔn)確性、重復(fù)性高的單萜化合物檢測方法。利用本試驗(yàn)建立的方法,在模擬葡萄酒中檢測到有少量單萜化合物生成,證實(shí)了LA-FR 釀酒酵母菌株可以從頭合成單萜化合物,進(jìn)而為深入研究單萜化合物合成機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。