陳藝娟，吳異健，黃一帆，吳寶成

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

番鴨呼腸孤病(Muscovy duck reovirus，MDRV)早在1950年國外已有報道[1]。1996年，在我國部分地區(qū)開始出現(xiàn)一種以肝、脾出現(xiàn)多處灰白色壞死點(diǎn)為主要病變特征的急性傳染病，俗稱番鴨肝“白點(diǎn)病”、“花肝病”。1998年在福建、廣東、浙江等省番鴨養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)流行，病毒感染番鴨主要表現(xiàn)為精神萎頓，軟腳，排深色帶有黏液糞便，部分病鴨趾關(guān)節(jié)或附關(guān)節(jié)有不同程度的腫脹，耐過鴨生長發(fā)育受阻，內(nèi)臟器官(包括心、肝、脾等)有大量的灰白色呈花斑樣的壞死灶[2-4]，2001年吳寶成等證實該病原為MDRV[5]，并且發(fā)現(xiàn)該病毒可以誘導(dǎo)肝、脾發(fā)生細(xì)胞凋亡[3，6]。細(xì)胞凋亡是基因控制的無炎癥反應(yīng)的生理性死亡，細(xì)胞凋亡以宿主細(xì)胞的“主動”死亡阻止病毒增殖的方式可在機(jī)體抗病毒感染中發(fā)揮作用，但另一方面，又可能引起免疫細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能下降，臨床上出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象；壞死則為病毒感染細(xì)胞的被動性死亡，并常伴有炎癥反應(yīng)的病理性死亡。顯然，病毒感染番鴨臨床致病性的表現(xiàn)程度與細(xì)胞壞死和凋亡之間存在密切的關(guān)系。近年來，國內(nèi)外研究控制凋亡的藥物有很多，中藥多糖能夠有效調(diào)節(jié)病毒感染后的細(xì)胞凋亡并具有抗病毒作用，其中猴頭菇多糖具有抗衰老、抗病毒和降血脂等功能已經(jīng)得到實驗證實[7]?，F(xiàn)代研究表明猴頭菇多糖：一是增強(qiáng)免疫功能；可提高機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬功能；并促進(jìn)溶血素生成，增加體液免疫的能力，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖。二是防癌抗癌：能抑制黃曲霉素對大鼠的致肝癌作用；多糖對自然殺傷(NK)細(xì)胞活性有明顯的激活作用。三是具有抗氧化、抗病毒和降血脂等藥理作用。本實驗擬通過比較分析猴頭菇多糖對MDRV感染雛番鴨組織病變及細(xì)胞凋亡的影響，初步探討猴頭菇多糖抗病毒感染有效性的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物 MDRV為福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存的YB分離株。雛鴨來源于福州某鴨場。

1.2 試驗分組 將100只1日齡的健康雛番鴨隨機(jī)分A、B、C、D和E組(即猴頭菇多糖高、中、低劑量組，病毒對照組和空白組)每組20只，空白組和其他各組分室隔離飼養(yǎng)。從1日齡起給藥組飲水添加給藥(高、中、低劑量組添加量為0.03%、0.02%、0.01%)直至剖殺之日結(jié)束給藥，飼喂雛鴨全價飼料，自由飲水采食。另取20只1日齡雛番鴨每只腿部肌肉注射YB株病毒0.6 mL，3日齡時，A、B、C和D組每組各放5只同居感染(此時定為同居感染第1 d)。

1.3 實驗中藥 猴頭菇多糖(含量80%左右)，上海朝翔技術(shù)有限公司惠贈。

1.4 臨床觀察 試驗期間每日進(jìn)行臨床觀察，記錄臨床癥狀，統(tǒng)計并比較各組發(fā)病情況。

1.5 肝、脾的病理學(xué)觀察

1.5.1 剖檢觀察 同居感染后第2 d、6 d、9 d，12 d每組隨機(jī)抽取5只鴨心臟采血處死后剖殺，并對發(fā)病死亡的雛鴨剖檢，觀察并記錄各組肝和脾臟等器官的肉眼變化。

1.5.2 HE染色觀察 在剖檢的同時，按常規(guī)方法采取肝脾樣品，用4%的多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色光鏡觀察病記錄病理組織學(xué)變化。

1.5.3 細(xì)胞凋亡情況 在剖檢的同時，按常規(guī)方法采取肝、脾樣品，用4%的多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡并計算凋亡指數(shù)，以分析病毒感染后給藥組和不給藥組凋亡的變化規(guī)律。凋亡指數(shù)AP%=一定范圍內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/同一范圍內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，每張切片在顯微鏡下隨機(jī)取5個視野(×400)，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)，取其平均值[8]。

1.6 血液生化指標(biāo)的檢測 用相同方法同居感染后12 d每組抽取10只鴨子心臟無菌采血，分離血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性的測定采用賴氏法進(jìn)行測定，試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司

1.6.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性的測定采用賴氏法進(jìn)行測定，試劑盒均購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司

1.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 試驗各組臨床癥狀觀察結(jié)果及分析 同居感染各組都出現(xiàn)了比較典型的呼腸孤病毒感染的臨床癥狀。但從表1的數(shù)據(jù)顯示，猴頭菇高、中、低劑量組出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀的時間比病毒對照組晚，其中高劑量組和病毒對照組相比差異不明顯，而中劑量組較明顯。對照組未觀察到臨床癥狀。

2.2 剖檢變化 隨著日齡增大同居感染各組表現(xiàn)出不同程度的肉眼變化，如同居感染第2 d病毒對照組脾臟開始腫大，表面及切面有大量灰白色壞死點(diǎn)。同居感染第6 d病毒對照組肝臟腫大，出血呈淡褐紅色，質(zhì)脆，表面及實質(zhì)有大量肉眼可見灰白色、大小不等的壞死點(diǎn)，有的甚至連成花斑狀。猴頭菇組的肝臟、脾臟有輕微腫大，但無明顯壞死點(diǎn)。空白組正常。初步結(jié)果表明，猴頭菇多糖對病毒感染后的肝脾有一定的保護(hù)作用。

表1 實驗各組出現(xiàn)臨床癥狀的時間分布情況Table 1 Time table of clinical symptoms in each group

2.3 HE染色結(jié)果分析 MDRV感染后，光學(xué)顯微鏡下觀察可見肝、脾、腎、法氏囊等都發(fā)生了不同程度的組織病理學(xué)變化，其中以肝和脾器官的出血及不同程度變性壞死為主要特征。肝臟：病毒對照組同居感染2 d后，病毒對照組感染番鴨肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，肝細(xì)胞空泡變性，有少量的炎性細(xì)胞和淋巴單核細(xì)胞浸潤。病毒對照組同居感染6 d后，肝細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，少量肝細(xì)胞核碎裂，肝靜脈周圍淋巴細(xì)胞大量浸潤，顯示肝細(xì)胞嚴(yán)重變性和壞死(圖1、圖3)。病毒對照組同居感染9 d后，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完全消失，肝細(xì)胞呈廣泛性脂肪變性和空泡變性，嚴(yán)重的造成局灶性壞死，并見大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，有些肝細(xì)胞間及匯管區(qū)血管周圍有多量的散在炎性細(xì)胞浸潤。猴頭菇組同居感染2 d后無明顯變化，在同居感染6 d后見肝細(xì)胞水泡變性，但無明顯壞死灶(圖2)。同居感染9 d后血管周圍有少量的散在炎性細(xì)胞浸潤(圖4)，但壞死灶很少。脾臟：病毒對照組同居感染2 d后，白髓區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少甚至消失，紅髓明顯充血。病毒對照組同居感染6 d后出現(xiàn)明顯的壞死灶(圖5)，并見少量因淋巴細(xì)胞消失留下的小空腔。猴頭菇多糖組同居感染6 d后可見白髓網(wǎng)狀細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞少量減少，壞死灶不多。同居感染9 d后，猴頭菇多糖組比病毒對照組的脾體積明顯增大、數(shù)量增多，淋巴細(xì)胞數(shù)目也有所恢復(fù)(圖6)。對照組番鴨肝脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見異常組織學(xué)病理變化。

2.4 TUNEL法標(biāo)記檢測結(jié)果分析 MDRV感染后，用TUNEL法染色觀察可見肝、脾等組織都出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞凋亡，肝臟：病毒對照組同居感染2 d后，3個劑量的猴頭菇多糖組感染番鴨肝細(xì)胞均高于病毒對照組，同居感染后6 d，高、中、低猴頭菇多糖劑量呈下降趨勢，但仍高于病毒對照組，在同居感染后第9 d，高、中、低劑量猴頭菇多糖給藥組對應(yīng)番鴨的肝細(xì)胞凋亡率開始低于病毒對照組。脾臟：病毒對照組同居感染2 d后，3個劑量的猴頭菇多糖給藥組感染番鴨脾細(xì)胞均高于病毒對照組，但病毒對照組的凋亡率曲線呈上升趨勢而3個劑量猴頭菇給藥組均有下降的趨勢。同居感染后6 d，病毒對照組的脾細(xì)胞凋亡率高于猴頭菇多糖高、中劑量給藥組，同居感染后第9 d、第12 d，病毒對照組感染番鴨的脾細(xì)胞的凋亡率均高于其他各組?？瞻捉M對應(yīng)的肝脾細(xì)胞凋亡很少?？傊c病毒對照組相比，給藥組的肝脾在病毒感染早期細(xì)胞凋亡較多，在同居感染后期細(xì)胞凋亡較少，即猴頭菇多糖能促使呼腸孤病毒感染后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的時間提前。具體如圖7，圖8所示：

2.5 血液生化指標(biāo)的檢測 AST和ALT活性檢測：病毒感染后的番鴨血清的AST和ALT活性，與E組比較，A、B組差異不顯著，C組差異顯著(p＜0.05)，D組差異極顯著(p＜0.01)。 與D組比較，A、B、C組均差異顯著(p＜0.05)，E組差異極顯著(p＜0.01)。表明，病毒感染后，造成肝臟一定的損傷，患鴨血清的AST和ALT活性均有不同程度的升高，猴頭菇多糖高、中、低劑量均能在一定程度上降低患鴨血清的AST和ALT活性。

3 討論

目前真菌多糖的藥理作用已引起醫(yī)藥界的高度重視，國內(nèi)外對多糖研究證實，真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等功能。如張秀娟等研究表明，靈芝多糖對T細(xì)胞及其亞群有明顯的影響，它可增加混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中T細(xì)胞的回收量，在增加Lyt2+和L3T4+細(xì)胞回收量的同時，還可增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷功能[9]。唐省三等用猴頭菇、香菇、茯苓3種真菌的多糖，配以葡萄籽多酚和甘草酸，制成復(fù)合多糖，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合多糖可明顯升高S180肉瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性[10]。還有研究報道多糖對多種病毒，如艾滋病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒等有抑制作用[11]。尤其在抗HIV方面，硫酸酯化多糖因為其活性明確，已成為近年來的研究熱點(diǎn)[12]。作為真菌多糖的一種，猴頭菇多糖具有抗衰老、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等功能。目前MDRV感染番鴨的臨床治療效果還不甚理想。本實驗表明，添加猴頭菇多糖組的與病毒對照組相比，患鴨感染率和死亡率均有所下降。添加猴頭菇多糖組的番鴨感染呼腸孤病毒后，其脾臟等免疫組織的淋巴細(xì)胞數(shù)比病毒對照組均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，脾小結(jié)的體積明顯增大、數(shù)量增多，肝脾的壞死灶減少。這與猴頭菇多糖能減輕病毒感染所引起的免疫抑制，促進(jìn)免疫器官的恢復(fù)和發(fā)育有關(guān)。此外，猴頭菇多糖的抗氧化作用能清除體內(nèi)過量的自由基，減少其造成的組織損傷。這種解釋與他人研究表明的MDRV感染后引起免疫抑制的發(fā)病機(jī)制相一致。

表2 試驗鴨血清AST和ALT活性的變化Table 2 Changes of the serum AST and ATT activity in experimental ducklings

氨基轉(zhuǎn)移酶是目前應(yīng)用最廣最有價值的實驗室檢測肝功能之一，是肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)。其中主要是ALT和AST。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在于肝、腎、心肌、骨骼肌、胰、脾、肺、紅細(xì)胞和血清中，以肝臟含量最高，主要存在于肝細(xì)胞漿中，肝內(nèi)含量約為血中的100倍，如果釋放的酶全部保持活力，只要1%的肝細(xì)胞壞死，可使血清酶活力增加1倍。AST主要分布于細(xì)胞漿和線粒體中，肝臟谷轉(zhuǎn)氨酶活性高于循環(huán)內(nèi)總活性的100000倍，因此血清轉(zhuǎn)氨酶活性變化可以反映肝細(xì)胞損害程度[13]。病毒感染后的番鴨血清的AST和ALT活性，與E組比較，A、B組差異不顯著，C組差異顯著(p＜0.05)，D組差異極顯著(p＜0.01)。與D組比較，A、B、C組均差異顯著(p＜0.05)，E組差異極顯著(p＜0.01)。說明猴頭菇多糖能在一定程度上減輕該病毒感染引起的肝臟損傷，輔助受損小鼠的肝功能的恢復(fù)。這與試驗猴頭菇多糖組比病毒對照組“肝白點(diǎn)”減少相一致。

但我們發(fā)現(xiàn)，猴頭菇多糖通過調(diào)整細(xì)胞凋亡對該病毒感染有一定的控制效果，攻毒各組均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但多糖組比病毒對照組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的時間提前，這樣的“提前”意義重大，很可能是猴頭菇多糖抗病毒的一個重要原因，也可能成為中藥多糖通過調(diào)控細(xì)胞凋亡來防治病毒病的一個新思路。

病毒進(jìn)入細(xì)胞后表達(dá)的一些病毒蛋白將會引發(fā)細(xì)胞的凋亡過程，而凋亡的發(fā)生對于病毒的大量復(fù)制顯然是非常不利的，同時也是對周圍未感染細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制。經(jīng)過長期的選擇和進(jìn)化，很多病毒具有了抗凋亡的機(jī)制，為了完成其自身的復(fù)制周期，它們或者是通過表達(dá)病毒抗凋亡蛋白，或者是通過激活宿主的抗凋亡機(jī)制來阻止或者是延遲病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡，直到它們已經(jīng)產(chǎn)生足夠多的子代病毒。從病毒與宿主的相互作用來看，被病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡是機(jī)體抗病毒的一種防御機(jī)制，而病毒產(chǎn)物抑制或者延遲被感染細(xì)胞發(fā)生凋亡，則是病毒的一種生存機(jī)制[14]。有研究報道，腺病毒在感染過程的不同階段產(chǎn)生不同的凋亡調(diào)節(jié)蛋白：早期產(chǎn)生抑制蛋白，抑制靶細(xì)胞凋亡并促進(jìn)病毒增殖；晚期產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)蛋白，致使靶細(xì)胞死亡并促進(jìn)擴(kuò)散[15]。可見，試驗猴頭菇多糖能在病毒感染早期克服病毒的抗凋亡的機(jī)制，誘導(dǎo)感染細(xì)胞與病毒“同歸于盡”，并且細(xì)胞凋亡不同于壞死，不會引起炎癥反應(yīng)，這有利于清除病毒和保護(hù)其他未感染細(xì)胞。猴頭菇多糖還抑制感染后期的細(xì)胞過度凋亡，這樣既有利于防治病毒的擴(kuò)散，也可以防止因感染后期免疫細(xì)胞大量凋亡而引起的免疫抑制。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但通過多糖來調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而控制病毒感染，這是抗病毒的一個新思路。

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