肖國生，李 娟，黃小波，曹三杰，文心田

(1.重慶三峽學(xué)院生物系，重慶 404000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院基因芯片實驗室，四川雅安 625014）

胸膜肺炎放線桿菌鐵離子攝取的分子機(jī)理

肖國生1*，李 娟1，黃小波2，曹三杰2，文心田2

(1.重慶三峽學(xué)院生物系，重慶 404000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院基因芯片實驗室，四川雅安 625014）

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App）是豬胸膜肺炎的病原，可引起各種年齡的豬發(fā)病[1]。目前，App有2個生物型和15個血清型：1型～12型、15型為生物I型，13型和14型為生物II型[2]。所有血清型均能引起豬發(fā)生胸膜肺炎，但生物II型比生物I型的毒力弱，有些血清型毒力明顯更強(qiáng)[1，3]。App致病性強(qiáng)，可通過空氣傳播，各血清型之間交叉保護(hù)力低。因此，很難被有效控制，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

App作為一種高致病性病原，引起豬發(fā)病需要經(jīng)過定植、逃避宿主防御和損傷宿主組織3個基本階段[1]。當(dāng)該菌粘附于豬呼吸道上皮細(xì)胞后，其定居部分取決于細(xì)菌獲取生長所有必需營養(yǎng)成分的能力。鐵離子是細(xì)菌生長必需的元素，鐵離子常在Fe-S原子簇中與硫結(jié)合，作為不同功能酶的催化中心，參與呼吸、ATP合成、DNA復(fù)制和修復(fù)等。另外，鐵離子也是一種調(diào)控許多毒力因子表達(dá)的環(huán)境信號分子。但是，在宿主體內(nèi)，胞外鐵離子常與糖蛋白、乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等外分泌腺分泌物結(jié)合，而大部分胞內(nèi)鐵離子則以亞鐵血紅素的蛋白形式存在，如血紅蛋白(Hb）[2]。這種多方式螯合作用降低了自由鐵離子的濃度，其濃度可低于10-24M，遠(yuǎn)低于維持細(xì)菌生長的水平(10-6～10-8M）[2，4]。App為了抵抗宿主對鐵離子的限制，能在宿主體內(nèi)生存，細(xì)菌表達(dá)多種與鐵離子攝取有關(guān)的因子，進(jìn)化形成了多種具有高親和性的獲鐵系統(tǒng)以幫助它從豬體內(nèi)攝取生長所必需的鐵離子。這些獲鐵系統(tǒng)都是TonB依賴的，TonB作為能源有促進(jìn)從細(xì)胞表面結(jié)合有鐵螯合物的外膜蛋白中鐵離子的吸收。轉(zhuǎn)鐵蛋白、Hb或嗜鐵素中的鐵離子跨外膜運(yùn)輸都依賴于ExbB-ExbD-TonB系統(tǒng)。位于細(xì)胞質(zhì)膜的Exb-TonB復(fù)合體將來自質(zhì)子動力勢的能量轉(zhuǎn)移至外膜上的鐵受體，一旦配體與鐵受體結(jié)合，誘導(dǎo)構(gòu)象發(fā)生變化，構(gòu)象的變化給配體-受體發(fā)出信號，要求依賴TonB的能量轉(zhuǎn)移[2]。目前，從App中鑒定出2種TonB系統(tǒng)：TonB1系統(tǒng)與tbpBA相關(guān)，其基因簇為tonB1-exbB1-exbD1，是該菌特有的；TonB2系統(tǒng)對于App生長在以血紅素、豬Hb或鐵色素(Ferrichrome）作為唯一鐵源是必需的，其基因簇為exbB2-exbD2-tonB2。TonB2毒力作用遠(yuǎn)大于TonB1[5]。該菌充分利用宿主內(nèi)源性鐵(轉(zhuǎn)鐵蛋白、Hb）和外源性鐵源(嗜鐵素、螯合鐵），在能源系統(tǒng)和鐵攝取因子的幫助下通過獲鐵系統(tǒng)攝取鐵離子以克服在感染期缺鐵對細(xì)菌生存的影響[2，6-7]，見圖 1。

1 利用轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白攝取鐵離子

App的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(Tbp）是一種結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體，具有宿主專一性，只對豬的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有特異性結(jié)合。這個鐵攝取系統(tǒng)由2個鐵離子可抑制性表面成分組成：一個是TbpA蛋白，也稱Tbp1或TfbB，分子量為100 ku，其功能是構(gòu)成鐵離子通過外膜的跨膜通道；另一個蛋白是TbpB，也稱Tbp2或TfbA，分子量為60 ku，屬脂蛋白，錨定在外膜上，起輔助分子的作用[8-9]。TbpB在不同血清型間表現(xiàn)出高度的差異，具有型特異性免疫反應(yīng)[6]。2種蛋白都可從細(xì)胞表面與豬轉(zhuǎn)鐵蛋白的C形部位結(jié)合，但只有這2種蛋白相互作用才能最佳利用轉(zhuǎn)鐵蛋白，并以此作為唯一鐵源[10]。TbpB也能與血紅素結(jié)合[9]。在該菌中tbpA和tbpB基因與exbBD1基因相連，呈共轉(zhuǎn)錄[5，11]。ExbB1和ExbD1形成一個內(nèi)膜蛋白復(fù)合體，與TonB1相連，為受體提供能量使鐵離子通過外膜，對于該菌利用轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵離子是必需的。exbB1和tonB1雙轉(zhuǎn)座子突變株無毒力，說明ExbB1-exbD1-TonB1復(fù)合體在鐵離子攝取中扮演重要作用[12]。Tbps在該菌感染過程中表達(dá)卻下調(diào)[13]。因此，其它獲鐵系統(tǒng)在該菌感染后期是必要的。

2 利用血紅蛋白受體攝取鐵離子

在限鐵條件下，從App外膜蛋白中純化獲得2種分子量大約為75 ku和105 ku的血紅蛋白結(jié)合蛋白，為非脂蛋白[14]。75 ku蛋白除能結(jié)合Hb外還能結(jié)合血紅素，與其它革蘭氏陰性菌的鐵調(diào)控外膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TonB依賴受體有一致性[2]。105 ku蛋白為App的血紅蛋白受體(HgbA），與巴氏桿菌科的HgbA有很高的同源性。hgbA基因長2 838 bp，蛋白分子量為104.9 ku，由946個氨基酸組成，含有一個23氨基酸的信號肽，HgbA突出于外膜的結(jié)構(gòu)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可能具有與Hb和亞鐵血紅素結(jié)合的功能[15]。hgbA基因存在于所有1型～15型菌株中，具有保守性，而HgbA負(fù)責(zé)從Hb中獲取鐵離子。hgbA基因缺失突變株不能在僅有Hb作為鐵源的培養(yǎng)基中生長，Hb的利用被阻止[15，16]，且其毒力減弱，HgbA對該菌的毒力起到了一定作用[17]。但HgbA是以何種方式將Hb中的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)，是否還需要其它蛋白共同介導(dǎo)血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)仍不清楚。

HgbA是App唯一的血紅蛋白受體，但不是唯一能結(jié)合Hb的物質(zhì)，75 ku外膜蛋白和LPS也能與Hb發(fā)生結(jié)合[14，18]。Deslandes等研究該菌在限鐵環(huán)境下基因轉(zhuǎn)錄譜時發(fā)現(xiàn)了一個新的基因簇，由2個ORFs組成，它們與腦膜炎奈氏球菌(N.meningitides）的血紅蛋白受體(HmbR）有43%的一致性，HmbR對Hb具有高親和性，能剝奪Hb中的血紅素，然后將血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)內(nèi)[19]。經(jīng)推定，胸膜肺炎線桿菌的HmbR的分子量為76.7 ku[19]，與75 ku蛋白分子量接近。但App的HmbR是否與腦膜炎奈氏球菌的HmbR一樣參與鐵離子的獲取，與已知的75 ku蛋白是否為同種蛋白，待進(jìn)一步證實。

3 利用嗜鐵素受體攝取鐵離子

App除可利用Tbp和HgbA 2個獲鐵系統(tǒng)從宿主內(nèi)源性含鐵物質(zhì)中獲取鐵離子外，還可以利用嗜鐵素受體(FhuA）從含鐵的嗜鐵素中攝取鐵離子，從而滿足細(xì)菌生長的需要[7]。嗜鐵素(Siderophores）是好氧菌和兼性厭氧菌的一種產(chǎn)物，在低鐵離子條件下產(chǎn)生的，分子量小于1 ku，為特異的高親和性鐵螯合劑，能與乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白競爭鐵離子。Fhu系統(tǒng)也是TonB依賴，由fhuC、fhuD、fhuB和fhuA 4個基因組成一個Fhu操縱子，編碼的蛋白與大腸桿菌等其它幾種細(xì)菌的Fhu系統(tǒng)的蛋白同源[20]。fhuA基因長約2 088 bp，其推導(dǎo)的FhuA蛋白分子量為74.75 ku，為一種嗜鐵素受體，屬外膜蛋白，具有與TonB結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)表達(dá)。與其它鐵攝取系統(tǒng)不同，細(xì)菌在低鐵離子的環(huán)境中生長其fhuA基因的表達(dá)并不上調(diào)，而且不被鐵離子調(diào)控[21]。fhuA在1型～15型中保守，fhuA突變株與原代株毒力沒有變化，說明不是App毒力的必要成分[17，22]，但當(dāng)fhuA缺失后其它鐵攝取系統(tǒng)不受影響，而鐵色素的吸收停止[21]，F(xiàn)huA對細(xì)菌性外源異羥肟酸鐵(Ferric hydroxamate）類物質(zhì)具有特異性[20]。fhuD基因長954 bp，編碼的FhuD蛋白分子量為35.6 ku，屬周質(zhì)蛋白，負(fù)責(zé)將異羥肟酸鐵從外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜；fhuC基因長765 bp，編碼的FhuC蛋白分子量為28.5 ku，fhuB基因長1 953 bp，編碼的FhuB蛋白分子量為69.4 ku，F(xiàn)huC和FhuB屬質(zhì)膜結(jié)合蛋白，為轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員。FhuC和FhuB是將異羥肟酸鐵內(nèi)化的ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體的組件[17，20]。

4 Yfe獲鐵系統(tǒng)

Deslandes等研究發(fā)現(xiàn)在App中可能還存在一個Yfe-ABCD系統(tǒng)，它的基因在限鐵時表達(dá)上調(diào)，其蛋白分別與多殺性巴氏桿菌的YfeABCD有63%、76%、75%和66%的同源性[19]。Yfe系統(tǒng)具有利用螯合鐵的功能[23]。App的Yfe系統(tǒng)的各基因排列與多殺性巴氏桿菌的同源基因不同，yfeB在yfeA的下游，在yfeA上游還有3個ORFs，緊接著反向有2個ORFs，命名為omp64，在第二個omp64下游160 kb才是yfeCD基因[19]。據(jù)推導(dǎo)，YfeA為螯合鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬周質(zhì)結(jié)合蛋白，目前無法準(zhǔn)確定位，但預(yù)測不會在胞質(zhì)內(nèi)；YfeB為螯合鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬ATP結(jié)合蛋白；YfeCD為螯合鐵轉(zhuǎn)運(yùn)組件，屬膜蛋白，位于胞質(zhì)膜；Omp64為外膜蛋白，為TonB依賴性受體，位于細(xì)胞外膜。根據(jù)蛋白功能的推測，YfeABCD-Omp64可能是該菌一個新的獲鐵系統(tǒng)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)螯合鐵中的鐵離子，但這個系統(tǒng)中各蛋白的更詳功能和定位尚不清楚。

5 Afu轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)

一旦鐵離子從外膜運(yùn)至周質(zhì)，要到達(dá)細(xì)胞質(zhì)一般都由周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)完成[1-2]。從App中鑒定出一個afuABC操縱子，它編碼一個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，與已知的周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)同源[24]。afuA基因長1 041 bp，編碼的AfuA蛋白為周質(zhì)鐵結(jié)合蛋白，由346氨基酸組成；afuB基因長2 064 bp，編碼的AfuB蛋白由663個氨基酸組成，有24個前導(dǎo)序列，是一個高疏水的胞質(zhì)膜整合蛋白，含有2個一致的透明質(zhì)酸酶基序，基序位于胞內(nèi)環(huán)，與ATP結(jié)合蛋白相互作用；afuC基因長1 047 bp，編碼的AfuC蛋白由348個氨基酸組成，是一個親水的外周質(zhì)膜蛋白，含有ATP結(jié)合基序[24]。仍不清楚該鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是否為該菌唯一一個負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子通過胞質(zhì)膜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

6 脂多糖(LPS）在App捕獲鐵離子中的作用

LPS屬細(xì)胞表面多糖，已知含有3個區(qū)：脂質(zhì)A、寡糖核心和O-抗原。LPS主要起到粘附的毒力作用，使App粘附于豬呼吸道上皮細(xì)胞[1-2]。LPS除了具有粘附的毒力作用外，還能結(jié)合豬Hb[25]。O-抗原多變，與毒力無關(guān)，而寡糖核心是細(xì)菌粘附細(xì)胞的必需組件，LPS核心突變株則完全無毒[2，26]，而與豬Hb結(jié)合的區(qū)域是脂質(zhì)A[25]。LPS與豬Hb結(jié)合后能影響LPS某些物理和生物學(xué)特性，但與豬Hb結(jié)合的具體作用仍不清楚，也許LPS對豬Hb只是起到一個非特異性結(jié)合受體的作用，或在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到一個“碼頭”作用，一旦LPS與豬Hb結(jié)合后，豬Hb被轉(zhuǎn)移到特異性受體上，如HgbA[18]。然而，LPS結(jié)合豬Hb后是如何參與隨后鐵離子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，同時還需要哪些外膜蛋白和周質(zhì)蛋白仍需進(jìn)一步研究。

7 Apx外毒素在細(xì)菌捕獲鐵離子中的作用

App可以分泌4種不同的外毒素：ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIVA，它們是引起豬發(fā)病的最重要毒力因子[27-28]。ApxI(105 ku）具有強(qiáng)溶血活性和細(xì)胞毒性；ApxII(103 ku～105 ku）具有弱溶血活性和中等細(xì)胞毒性[27]；ApxIII(120 ku）不能溶解豬紅細(xì)胞，但對肺泡巨噬細(xì)胞和多核白細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性[27]；ApxIVA(170 ku～202 ku）只能在體內(nèi)表達(dá)，具有強(qiáng)免疫原性和弱溶血性[28]。Apx外毒素在該菌捕獲鐵離子過程的作用可能主要是裂解紅細(xì)胞釋放Hb和血紅素，為細(xì)菌提供必要的內(nèi)源性鐵源，然后通過HgbA、LPS和OMP等獲取其中的鐵離子。但是在轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，在限鐵離子環(huán)境下只有apxIC基因表達(dá)呈輕微上調(diào)，而apxIABD并不超表達(dá)[19]。

8 其它可能與鐵離子攝取有關(guān)的因子

隨著對App全基因組及其基因表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)有更多的基因參與鐵離子攝取和調(diào)控。Deslandes等研究發(fā)現(xiàn)，該菌在限鐵離子環(huán)境下生長至少有210個基因表達(dá)存在差異，其中92個基因表達(dá)上調(diào)[19]，可能還存在尚未被發(fā)現(xiàn)的鐵攝取系統(tǒng)和因子。在研究中他們還發(fā)現(xiàn)了一個由4個ORFs組成的基因簇，第一個ORF命名為fetB2，編碼一個獨特的蛋白，預(yù)測其定位于周質(zhì)，與周質(zhì)金屬結(jié)合蛋白TroA超家簇有相似性[19]。通過序列分析，與其它已知和推測的周質(zhì)結(jié)合蛋白同源，許多同源的周質(zhì)結(jié)合蛋白參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。fetB2下游的3個ORFs可能編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的成分，下游第3個ORF可能編碼ATP酶的成分，可能定位于周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；其它2個ORFs可能位于周質(zhì)內(nèi)[19]。fetB2是否為兒茶酚型嗜鐵素(Catecholtype siderophore）獲鐵系統(tǒng)的組成部分還需進(jìn)一步鑒定[19]。

9 結(jié)束語

App能表達(dá) Tbp、HgbA、LPS、OMP、Fhu、Afu和Yfe等多種因子參與鐵離子的攝取，進(jìn)化形成了完善的鐵攝取系統(tǒng)來抵抗在感染過程中缺鐵對細(xì)菌生存造成的影響。在該菌中可能還存在其它尚未被發(fā)現(xiàn)的鐵離子攝取因子，并且在已知的這些因子中仍有許多功能并不十分清楚。例如，HgbA是以何種方式將Hb中的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)，是否還需要其它蛋白共同介導(dǎo)血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)？LPS是以何種方式參與鐵離子的攝取，結(jié)合豬Hb的具體作用?75 ku外膜蛋白、HmbR、Yfe和FetB2等因子的具體功能和準(zhǔn)確定位等都有待深入研究。通過對細(xì)菌鐵離子攝取因子及其機(jī)制的深入了解，將有助于闡明App的致病機(jī)理，獲得有效的免疫成分和采取有效的預(yù)防措施。

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S852.61

B

1008-0589(2010）01-0077-04

2008-11-01

重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ081108）；重慶三峽學(xué)院科研項目(2007-SXXYYB-02）；重慶市萬州區(qū)科委項目(20081022）

肖國生(1972-），男，重慶奉節(jié)人，博士，副教授，從事微生物與分子生物學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：xgs03@163.com

(本文編輯：趙曉巖）