高曉宇，曹榮峰，張桂紅*，李守軍*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109)

犬流感是由犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起犬以體溫升高、咳嗽、流鼻液、食欲減退、呼吸困難為主要特征的疾病。2004年，在佛羅里達(dá)首次從犬體內(nèi)分離到流感病毒，該病毒是由甲型H3N8流感病毒引起，而且其遺傳性和抗原性與當(dāng)時(shí)的H3N8馬流感病毒非常相似[1]。2007年，在韓國出現(xiàn)了犬流感H3N2病毒，該病毒源于禽類，而且犬之間通過接觸可以傳播[2]。近幾年，本實(shí)驗(yàn)室在我國華南地區(qū)也分離到了CIV。鑒于CIV可以跨種和種內(nèi)傳播，以及危害犬類的健康，因此，建立CIV快速檢測技術(shù)，將對犬流感的監(jiān)測與防控發(fā)揮重要作用。

目前，實(shí)驗(yàn)室確診CIV常用2種方法，病毒分離鑒定和RT-PCR檢測方法。這2種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件。Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loopmediated isothermal amplification， LAMP)[3]。 該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增高效、快速、步驟簡單、鑒定簡便等優(yōu)點(diǎn)。迄今已建立了針對多種病原性細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等的LAMP檢測方法[4-7]，在耐藥性基因檢測[8]、家畜早期胚胎性別判定[9]等方面也有相關(guān)報(bào)道。本研究依據(jù)CIV的膜蛋白(M)基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了LAMP引物，建立了一種CIV的RT-LAMP早期快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株 CIVA/canin e/guangzhou/01/2006(H3 N2)株(CGZ1株)、試驗(yàn)所用犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)和犬副流感病毒(CPIV)等均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)系外科教研室分離保存。

1.2 試 劑 TRIzol LS Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、One Step RNA PCR試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；甜菜堿(Betaine)為Sigma公司產(chǎn)品；Bst DNA聚合酶大片段為北京紐英倫生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；熒光染料SYBR GREENⅠ為杰特偉公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照CIV膜蛋白(M)基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件MegAlign程序進(jìn)行分析，利用PrimerExplorer V4軟件在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP 引物(表 1)。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the primers

1.4 病毒RNA的抽提 參照TRIzol LS Reagent使用說明書進(jìn)行病毒RNA的抽提。

1.5 RT-LAMP方法的優(yōu)化及建立 根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對 MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物濃度等分別進(jìn)行了優(yōu)化。

根據(jù)引物Tm值，將溫度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次遞增，確定最佳退火溫度。反應(yīng)時(shí)間按30 min、45 min、60 min、90 min、120 min優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.6 RT-LAMP方法的靈敏性 將抽提所得的CIV總RNA 10倍稀釋至10-6，并使用紫外分光光度計(jì)測定稀釋后各個(gè)梯度的RNA濃度分別為100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01 pg。對上述各濃度RNA用RT-LAMP和RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測。一步法RT-PCR按照One Step RNA PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.7 RT-LAMP方法的特異性 分別以CDV、CPV和CPIV作為樣品，同時(shí)設(shè)立陰性對照，采用上面優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測所建立RT-LAMP方法的特異性。

1.8 RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的分析 RT-LAMP反應(yīng)最終產(chǎn)生白色混濁焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼或?qū)崟r(shí)濁度計(jì)進(jìn)行結(jié)果觀察，而添加1 μL SYBR Green I DNA熒光染料(橙色)可進(jìn)行可視化觀察，在室溫放置5 min，紫外光下觀察，陽性產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光。使用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對產(chǎn)物進(jìn)行分析，陽性反應(yīng)呈現(xiàn)彌散型條帶。

1.9 臨床樣品的檢測 通過病毒分離、血凝(HA)和血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)檢測為CIV陽性的44份人工感染犬流感病毒的組織樣品，用RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR 2種檢測方法，對比其符合率。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)狀引物對LAMP反應(yīng)的影響 環(huán)狀引物L(fēng)oopF、LoopB結(jié)合于LAMP反應(yīng)生成的啞鈴狀產(chǎn)物的環(huán)狀部位，同時(shí)啟動DNA鏈置換反應(yīng)，生成一系列核酸結(jié)構(gòu)，上述產(chǎn)物可以進(jìn)一步用于LAMP反應(yīng)，從而加速LAMP反應(yīng)速度[12]。本研究使用定點(diǎn)凝膠電泳檢測的(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)方法加入或不加入環(huán)狀引物L(fēng)oopF、LoopB的LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。結(jié)果表明：在LAMP反應(yīng)中使用環(huán)狀引物可以有效的提高反應(yīng)速度和效率。

2.2 優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)化的反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件為63℃45 min，80℃2 min結(jié)束。

表2 CIV RT-LAMP的最佳反應(yīng)體系Table 2 Optimized reaction system for CIV RT-LAMP

2.3 RT-LAMP檢測結(jié)果 按照優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對試驗(yàn)樣品進(jìn)行RT-LAMP檢測，結(jié)果出現(xiàn)典型的LAMP條帶(圖1)，初步表明該方法可用于CIV的檢測。

2.4 RT-LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 RT-LAMP反應(yīng)體系中，生成的磷酸鹽可與鎂離子結(jié)合生成白色的副產(chǎn)物-焦磷酸鎂，通過比較其濁度可對結(jié)果進(jìn)行判定，陽性反應(yīng)有白色沉淀，透明則為陰性。同時(shí)RT-LAMP反應(yīng)體系存在擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I(橙色)，紫外燈下肉眼即可觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光；空白對照或其它毒株DNA則不發(fā)生顏色變化(圖2)。

2.5 RT-LAMP敏感性檢測結(jié)果 圖3的第6泳道有稍淺的條帶出現(xiàn)，在用SYBR GREENⅠ進(jìn)行熒光染色后也有熒光出現(xiàn)，表明所建立的RT-LAMP方法的最小檢測限為10-5即0.1 pg CIV RNA，即總RNA量約為0.1 pg。與RT-PCR方法相比，靈敏度更高(圖 4)。

2.6 RT-LAMP特異性試驗(yàn) 分別以CIV陽性樣品和CDV、CPV和CPIV樣品，同時(shí)設(shè)立陰性對照作RT-LAMP特異性檢測，結(jié)果以CIV陽性樣品為模板的泳道出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，其它樣品均呈陰性反應(yīng)。結(jié)果表明引物對CIV具有特異性，可區(qū)分與犬流感病癥相似的一些犬類傳染病(圖5)。

2.7 RT-LAMP臨床試驗(yàn) 對CIV人工感染犬的組織樣品，應(yīng)用本研究建立的RT-LAMP方法和RTPCR方法檢測，結(jié)果表明：對肺臟、心臟、腎臟組織，2種方法的陽性率檢測均達(dá)到100%；對肝臟、腦，RT-LAMP方法的敏感性要明顯高于RT-PCR方法。對44份臨床陽性樣品的檢測，RT-LAMP和RT-PCR方法的檢測結(jié)果的符合率為93.02%(表3)。

表3 應(yīng)用RT-LAMP與RT-PCR檢測人工感染CIV組織樣品Table 3 Comparison of sensitivity between RT-LAMP and RT-PCR assays for 44 clinical samples obtained from CIV-infected

3 討論

犬流感可在成犬之間的快速傳播，引起犬的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重的會造成犬只死亡。對美國、韓國流行的犬流感病毒研究表明，這些流感病毒來源于異種動物。流感病毒可以突破種間屏障，感染異種動物。犬作為寵物與人接觸密切，應(yīng)對犬流感引起足夠的重視。

建立一種行之有效的檢測方法對于開展CIV的綜合防治和疾病診斷具有十分重要的意義。目前已經(jīng)建立病毒分離，血凝(HA)、血凝抑制(HI)檢測方法以及RT-PCR方法。這些方法不僅實(shí)驗(yàn)條件要求高，而且耗時(shí)長，限制了其在基層獸醫(yī)診療單位的使用。LAMP方法是一種簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的基因擴(kuò)增法。本研究對CIV檢測的反應(yīng)條件，如引物設(shè)計(jì)、目的基因序列長度、環(huán)狀結(jié)構(gòu)大小及反應(yīng)體系等方面進(jìn)行了優(yōu)化[10]，并在體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，建立了CIV RT-LAMP檢測方法。研究結(jié)果表明所建立的CIV RT-LAMP檢測方法具有較高的特異性、良好的靈敏度。該LAMP檢測技術(shù)基本克服了目前在臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷CIV方面存在的一些不足，操作簡便、可在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增、無需復(fù)雜儀器設(shè)備、成本低，為臨床檢測提供了一個(gè)快速簡便的新方法，可以廣泛用于犬流感病毒的早期診斷及預(yù)防控制方面。

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