曲明陽* 鄭永勝 邢光明 趙 莉 李方華 馮秉安

1 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（116027）

2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科（116027）

3 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（116011）

右旋檸烯（D-limonene）是從中藥橘皮中提取有效單體成分，已經(jīng)被證明對多種腫瘤具有明顯的抑制作用。Fascin-1是一種重要的胞質(zhì)蛋白，決定著細胞微絲骨架的分布和活動，可能在細胞遷移、侵襲以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用[1]。本實驗將探討中藥提純單體右旋檸烯對乳腺癌細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的影響及其Fascin-1蛋白相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

右旋檸烯購自美國Sigma公司，純度97%；Matrigel購自美國Collaborative Research公司；纖維粘連蛋白購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細胞室；RPMI-1640培養(yǎng)液及MTT為Gibco BRL公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為購自美國Sigma公司；小牛血清購自中國聯(lián)星生物大連公司；Fascin-1單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品；Transwell小室為美國BD公司產(chǎn)品其上Polycarbonate濾膜孔徑為8μm；酶標儀及顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人乳癌高轉(zhuǎn)移細胞株MDA-MB-435購自中科院上海細胞所，以含10%小牛血清的RPMI-1640常規(guī)培養(yǎng)，以處于對數(shù)生長期的細胞備用。

1.2.2 共聚焦顯微鏡下乳腺癌細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)

預(yù)先置無菌蓋玻片于6孔板中，每孔接種104個人乳腺癌細胞MDAMB-435，待24h后確認細胞已經(jīng)爬片生長，加入不同濃度右旋檸烯常規(guī)培養(yǎng)24h，經(jīng)PBS液漂洗，4%甲醛固定25min后，用含有0.2%Tritonx-100和0.1%BSA的PBS溶液室溫下封閉滲透30min，然后在避光狀態(tài)下將預(yù)先配置好的5μg/mL的Phalloidin-FIFC在37℃下孵育1h，對照組用PBS代替。PBS液充分漂洗，PI復(fù)染30min，PBS液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架形態(tài)改變。

1.2.3 細胞侵襲實驗

在Transwell小室Polycarbonate濾膜上下面分別涂纖維粘連蛋白和 matrigel，風(fēng)干備用。取不同處理組的MDA-MB-435細胞100μL（2.0×104個）于Transwell小室，37℃溫育24h。70%乙醇固定，擦去濾膜內(nèi)表面細胞，HE染色，以中性樹脂封片。在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)每個視野細胞數(shù)目，取其平均值。以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.4 Western Blot分析

不同濃度右旋檸烯處理的乳腺癌細胞，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集上清，離心，冷凍干燥。變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，小牛血清封閉后，分別加入1∶400稀釋的一抗，4℃過夜，加二抗及顯色劑，檢測雜交蛋白，計算條帶的積分吸光度（IA）：IA=平均吸光度×面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 激光共聚焦細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)圖像

右旋檸烯作用后，以F-actin為基礎(chǔ)的微絲骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，質(zhì)膜突起和膜皺褶減少，細胞間排列較為規(guī)則，細胞基底外側(cè)微刺結(jié)構(gòu)明顯減少（圖1）。

圖1

2.2 右旋檸烯對乳癌細胞侵襲能力的影響

以0.25、0.125、0.0625mmol/L濃度的右旋檸烯預(yù)處理乳癌細胞24h后，收集細胞制成懸液進行對重組基底膜的侵襲實驗。結(jié)果表明，在無毒劑量下，右旋檸烯對乳癌細胞24h侵襲能力具有明顯的抑制作用（61.7±8.4、89.3±11.0和105.3±7.7），與對照組（166.1±12.2）比較差異顯著（P＜0.05），見表1和圖2。

表1 右旋檸烯對乳癌細胞侵襲能力的影響（n=3）

圖2

2.3 右旋檸烯對乳腺癌細胞Fascin-1蛋白表達的影響

以0.25、0.125、0.0625 mmol/L不同濃度藥物預(yù)處理24h后，收集乳腺癌細胞進行Western Blot蛋白免疫印記染色并計算積分光密度。結(jié)果顯示，相對分子質(zhì)量為56×103的Fascin-1蛋白表達受到抑制，以高濃度即0.25mmol/L最為明顯，各組積分光密度分別為（2.9±0.3）、（12.4±0.7）及（19.3±0.7），與對照組（28.6±0.5）比較差異顯著（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度右旋檸烯作用下，相對分子質(zhì)量為56×103的Fascin-1表達下調(diào)

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是其重要致死原因。因此，發(fā)現(xiàn)針對性的治療靶點以及低毒有效的抗轉(zhuǎn)移藥物具有重要的意義。細胞微絲骨架重排和其介導(dǎo)的細胞運動、細胞間作用是腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域研究熱點之一。F-actin是微絲骨架的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其在不同表型腫瘤細胞中分布及表達不同，參與多種腫瘤惡性化轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)移過程[2]。但F-actin廣泛存在于正常細胞和腫瘤細胞中，無組織表達特異性，缺乏臨床應(yīng)用價值。

Fascin-1是一種重要的胞質(zhì)蛋白，具有與F-actin結(jié)合的作用，并決定F-actin微絲骨架的分布和活動[3]。而且，在其他多種以actin為基礎(chǔ)的細胞運動相關(guān)結(jié)構(gòu)均作為關(guān)鍵結(jié)合蛋白出現(xiàn)，發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。Fascin-1定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足、微棘中。細胞的絲狀偽足和微棘與細胞的運動、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示Fascin-1蛋白可能在細胞遷移、侵襲以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用[2]。對上皮細胞的研究發(fā)現(xiàn)，當Fascin-1與F-actin結(jié)合，細胞伸出偽足和微棘，在細胞外基質(zhì)（ECM）上的遷移能力提高。更為重要的發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)ascin-1在多種正常組織器官的上皮中不表達或者低表達，而在該部位發(fā)生的惡性腫瘤中表達水平卻不同程度的提高，因此，F(xiàn)ascin-1在抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究中具有重要的實用價值[4,5]。

右旋檸烯是從中藥橘皮中提取的有效單體成份，具有廣譜的抗癌活性。我們的實驗結(jié)果表明，右旋檸烯作用后，乳腺癌細胞以F-actin為基礎(chǔ)的微絲骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，質(zhì)膜突起和膜皺褶減少，細胞間排列較為規(guī)則，細胞基底外側(cè)微刺結(jié)構(gòu)明顯減少。而進一步的體外侵襲實驗表明，右旋檸烯可以有效的抑制乳腺癌細胞的侵襲能力，侵襲基底膜細胞數(shù)顯著減少。提示右旋檸烯可以通過改變細胞骨架結(jié)構(gòu)來調(diào)控細胞運動，進而影響其侵襲行為。通過蛋白印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)，伴隨著細胞運動能力和侵襲能力的減弱，F(xiàn)ascin-1蛋白表達顯著下降，說明右旋檸烯是通過抑制該蛋白的表達，參與了乳腺癌細胞體外侵襲的調(diào)控。

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[2]Hashimoto Y. Roles of Fascin in human carcinoma motility and signaling: prospects for a novel biomarker?[J]. Int J Biochem Cell Biol,2005,37(9):1787-1804.

[3]Kureishy N,Sapountzi V,Prag A,et al. Fascins and their roles in cell structure and function [J].BioEssays,2002,24(4):350-361.

[4]Karasavvidou F,Barbanis S,Pappa D,et al. Fascin determination in urothelial carcinomas of the urinary bladder: a marker of invasiveness[J]. Arch Pathol Lab Med,2008,132(12):1912-1915.

[5]Kostopoulou E,Angelidou S,Daponte A.Fascin can be an auxiliary immunomarker of ovarian granulosa cell tumors: comparison with calretinin and inhibin-alpha[J].Eur J Gynaecol Oncol,2008,29(6):638-642.