王虹，吳琍，侯琳，崔文，陳慶峰，胡海燕

(青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院乳腺外科； 2 生物化學與分子生物學教研室)

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·腫瘤專題·

家族性乳癌病人乳癌組織及血清miRNA-26a、143與195表達及意義

王虹1，吳琍1，侯琳2，崔文1，陳慶峰1，胡海燕1

(青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院乳腺外科； 2 生物化學與分子生物學教研室)

目的 探討miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在家族性乳癌組織和血清中表達變化，以評價其對家族性乳癌早期診斷的潛在價值。方法 收集家族性乳癌、散發(fā)性乳癌病人的癌組織、癌旁正常組織及血清標本，并收集健康查體女性血清標本作為對照。提取血清及組織標本中的總RNA，進行逆轉錄和實時熒光定量PCR檢測miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在組織和外周血表達情況。結果 乳癌組織中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的表達水平均明顯低于癌旁對照組織(t=2.033～2.671，P<0.05)。家族性乳癌組織中miRNA-26a、miRNA-143表達水平低于散發(fā)性乳癌組織(Z=1.978、2.315，P<0.05)。乳癌病人血清miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195表達水平均明顯低于對照組(Z=2.211～5.922，P<0.05)；家族性乳癌病人血清中miRNA-143、miRNA-195表達水平低于散發(fā)性乳癌組(Z=3.103、2.478，P<0.05)。miRNA-143在組織與血清中的表達水平呈正相關(r=0.545，P<0.05)。結論 miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在乳癌病人癌組織及血清中表達水平下調，可能成為乳癌篩查和診斷的潛在生物學指標；miRNA-143在家族性乳癌病人癌組織及血清中表達水平明顯下調，可能成為家族性乳癌診斷的生物學指標。

微RNAs；乳腺腫瘤；逆轉錄聚合酶鏈反應

乳癌現(xiàn)已居我國女性惡性腫瘤死亡率之首，嚴重威脅女性健康[1-2]。在我國乳癌病人中,有5%～10%屬于家族性乳癌[3]。家族性乳癌指一個家系中一級及二級親屬中有2個或2個以上原發(fā)性乳癌和(或)卵巢癌病人[3]。該病的主要特點有：發(fā)病人數(shù)多、發(fā)病年齡早、雙側多發(fā)等。乳癌病人的預后與其臨床分期密切相關，而對其早期診斷非常重要。微小RNAs(miRNAs)是一類由18～25個核苷酸組成，內源性、進化上高度保守的單鏈非編碼RNA，具有轉錄后基因調控功能。miRNAs 具有多種生物學功能，在細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡過程中發(fā)揮調控作用[4-6]。某些miRNAs表達水平在乳癌組織與正常乳腺組織中存在差異，如miRNA-10b、miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-21、miRNA-155在乳癌組織中表達水平下降[7]。已有學者提出，循環(huán)血中miRNAs可以作為腫瘤及某些其他疾病的生物學標志物[8]。本研究旨在探討miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在家族性乳癌組織和血清中表達的變化，以評價其對家族性乳癌早期診斷的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2013年我院乳腺外科住院的家族性乳癌病人20例，散發(fā)性乳癌病人24例，均為成年女性，術前未接受化療、放療及內分泌治療，病理證實為浸潤性乳癌。于我院查體的健康女性20例作為健康對照。

1.2 試劑及引物

RNAiso Plus及SYBR熒光定量PCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMII)均購自寶生物工程(大連)有限公司；逆轉錄試劑盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)購自博日科技有限公司。引物以U6作為內參照，由上海桑尼生物科技有限公司設計并合成。見表1。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 TRIzol法提取總RNA 術前采集血清標本，術中取乳癌組織及癌旁對照組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)標本，置于-80 ℃超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆?。按照TaKaRa公司RNAiso Plus說明書的步驟提取組織及血清樣本總RNA。用紫外線分光光度計檢測總RNA濃度，每個樣本檢測3次取其平均值，所得A260/A280比值均在1.8～2.0之間。

1.3.2 莖環(huán)法逆轉錄合成cDNA 參照逆轉錄試劑盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)說明書提示加入試劑、引物及樣本RNA，逆轉錄得到目標cDNA。每管反應總體系為10 μL，其中，樣本RNA總量≤1 μL。反應條件為：55 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR 參照TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR反應，儀器型號為Light Cycler?96(羅氏)。反應體系為10 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)；融解95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s；最后50 ℃降溫30 s。以U6作為內參基因，分別擴增同一樣本的目標基因和內參基因，利用ΔCT方法[9]進行miRNA含量的相對定量。計算公式為2-△△CT。公式中的△CT=CT目標miRNA-CTU6，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組。

2 結 果

2.1 乳癌病人血清中miRNA-26a、miRNA-143及miRNA-195的表達水平

將對照組血清中miRNA-26a、miRNA-143和miRNA-195表達量設為1.00，乳癌組(散發(fā)性乳癌組并家族性乳癌組)、散發(fā)性乳癌組、家族性乳癌組血清中三者的相對表達量見表2。乳癌組血清中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相對表達量低于對照組(Z=2.211～5.922，P<0.05)；散發(fā)性乳癌組三者相對表達量低于對照組(Z=2.324～4.716，P<0.05)；家族性乳癌組血清中三者相對表達量亦低于對照組(Z=4.197～5.739，P<0.05);家族性乳癌組血清中miRNA-143、miRNA-195相對表達量低于散發(fā)性乳癌組，差異均有顯著意義(Z=3.103、2.478，P<0.05)。

2.2 乳癌組織miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的表達水平

表1 各引物序列及長度

乳癌組、散發(fā)性乳癌組、家族性乳癌組癌組織中3種miRNAs相對表達量見表3。乳癌組癌組織中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相對表達量低于癌旁對照組(t=2.033～2.671，P<0.05)；家族性乳癌組癌組織中3種miRNAs相對表達量低于癌旁對照組(Z=2.803～3.296，P<0.05)；散發(fā)性乳癌組癌組織中miRNA-26a、miRNA-195相對表達量低于癌旁對照組(Z=2.040、3.287，P<0.05)；散發(fā)性乳癌組癌組織中miRNA-143表達水平與癌旁對照組比較差異無顯著性(Z=0.471，P>0.05)；家族性乳癌組癌組織中miRNA-26a、miRNA-143相對表達量低于散發(fā)性乳癌組，差異有顯著意義(Z=1.978、2.315，P<0.05)。

表2 各組血清miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的相對表達量比較

表3 各組組織miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相對表達量比較

2.3 家族性乳癌組織與血清中miRNA-143表達水平的相關性

家族性乳癌病人癌組織與血清中miRNA-143的表達水平呈正相關(r=0.545，P<0.05)。

3 討 論

乳癌的臨床分期、腫瘤大小、腋窩淋巴結狀況、病理類型及病人年齡均可影響病人預后。家族性乳癌占乳癌的5%～10%，預后較差。有些乳癌病人發(fā)現(xiàn)較晚，失去手術尤其是保乳手術機會，輔助治療效果較差，預后不佳。乳癌的早期診斷已引起世界范圍內的重視。

自2005年首次報道m(xù)iRNA的表達變化與乳癌有關以來[7]，已有越來越多的miRNA被證實與乳癌發(fā)病有關，如miRNA-21[10]、miRNA-34a[11]和miRNA-155[12]等能促進惡性腫瘤的進展。

miRNA-26a在乳癌細胞系MDA-MB-231、 MCF-7、 MDA-MB-435中表達下調，其有抑制乳癌細胞克隆性增殖、遷移、介導試管中乳癌細胞凋亡、提高乳癌細胞對紫杉醇的敏感性等作用[13]。本實驗結果中，miRNA-26a在乳癌組織及血清中表達均下調，且在家族性乳癌組織中表達量低于散發(fā)性乳癌組織。

人類miRNA-143位于第5號染色體，在胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌、骨肉瘤和白血病等多種腫瘤中低表達。有研究表明，miRNA-143可通過靶向抑制補體調節(jié)蛋白CD46蛋白的表達水平，提高乳癌細胞對補體殺傷系統(tǒng)的敏感性，降低其免疫抑制能力，從而促進腫瘤細胞壞死或凋亡[14]。本實驗中miRNA-143在家族性、散發(fā)性乳癌組織及血清中表達均下調，在家族性乳癌表達量低于散發(fā)性乳癌，且組織及血清中表達水平呈正相關。

近來，許多學者先后發(fā)現(xiàn)miRNA-195在多種腫瘤中表達明顯下調，如胃癌、肝癌、膀胱癌、腎上腺皮質癌等。miRNA-195在乳癌組織和細胞系中表達明顯下調，該基因下調是由于其上游CpG島甲基化引起，其表達水平與乳癌惡性程度呈負相關。本實驗中，miRNA-195在乳癌組織及血清中表達均下調，且在家族性乳癌血清中表達量低于散發(fā)性乳癌。

綜上所述，miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在乳癌組織及血清中表達下降，可能成為乳癌診斷的潛在生物學指標。其中，miRNA-143在家族性乳癌組織及血清中表達低于散發(fā)性乳癌組，且組織和血清中的表達水平具有相關性，可作為家族性乳癌篩查和診斷的生物學標記物。

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(本文編輯 厲建強)

EXPRESSIONS OF miRNA-26a,143 AND 195 IN PATIENTS WITH FAMILIAL BREAST CANCER

WANGHong,WULi,HOULin,CUIWen,CHENQingfeng,HUHaiyan

(Department of Breast Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miRNA-26a, miRNA-143, and miRNA-195 in serum and tissue of patients with familial breast cancer (BC) and assess their potential value in the early diagnosis of this type of malignancy.MethodsCancer and paraneoplastic tissue and serum specimens of patients with familial and sporadic BC were collected, and healthy serum samples collected from women who came for medical examination were served as controls. Total RNA were extracted from all the serum and tissue samples, the expressions of three miRNAs (miRNA-26a, miRNA-143, miRNA-195) were quantified by using real-time PCR technique.ResultsThe expressions of miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in cancer tissues were lower than that in paraneoplastic specimens (t=2.033-2.671,P<0.05), and that in familial BC were lower than that in sporadic BC (Z=1.978,2.315;P<0.05). The expressions of serum miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in the BC patients were lower than that in the normal controls (Z=2.211-5.922,P<0.05), that familial BC were lower than that in sporadic BC (Z=3.103,2.478;P<0.05). A positive correlation was noted between tissue miRNA-143 expression and serum miRNA-143 (r=0.545,P<0.05).ConclusionDown regulation of serum and tissue miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in breast cancaer patients is likely to become a potential biological parameter for screening and diagnosis of breast cancer, and significant down regulation of tissue and serum miRNA-143 in familial breast cancer can probably become a biological parameter in the diagnosis of this familial malignancy.

microRNAs; breast neoplasms; reverse transcriptase polymerase chain reaction

2014-09-16;

2015-05-05

山東省自然科學基金(ZR2012HM089)與青島市科技局資助項目(12-1-3-5-(3)-nsh)

王虹(1987-)，女，碩士研究生.

吳琍(1967-)，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師。侯琳(1962-)，女，博士，教授，博士生導師。

R737.9

A

1008-0341(2015)04-0379-04