張鳳英，喬立君，張金玉，薛美蘭，葛銀林

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266021; 2 菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校)

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聯(lián)合下調(diào)Survivin和KSP表達(dá)對乳癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡影響

張鳳英1，2，喬立君1，張金玉1，薛美蘭1，葛銀林1

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266021; 2 菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校)

目的 探討聯(lián)合下調(diào)Survivin和紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白(KSP)基因表達(dá)對乳癌細(xì)胞增殖和凋亡影響。方法分別化學(xué)合成針對Survivin和KSP基因mRNA的小干擾RNA(siRNAs)，分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染乳癌細(xì)胞MDA-MB-231，以空白對照組作為陰性對照。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖率，熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測Survivin、KSP、Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)，蛋白印跡法檢測Survivin和KSP的蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果Survivin、KSP和Survivin+KSP轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞增殖率分別為0.66±0.01、0.67±0.03、0.54±0.01，轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞凋亡率分別為(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%、(45.73±1.11)%，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 307.81、1 450.76，P<0.01)，其中以雙干擾組細(xì)胞增殖率最低、凋亡率最高。在各轉(zhuǎn)染組中，Survivin、KSP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(F=48.68～490.20，P<0.01)，Bax mRNA的表達(dá)顯著增加(F=65.73，P<0.01)，Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著減少(F=27.41，P<0.01)。結(jié)論 利用siRNAs聯(lián)合下調(diào)Survivin和KSP基因表達(dá)，能有效抑制乳癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，效果優(yōu)于下調(diào)單個(gè)基因的表達(dá)。

乳房腫瘤；凋亡抑制蛋白質(zhì)類；驅(qū)動(dòng)蛋白；RNA干擾

實(shí)驗(yàn)室和臨床研究都證實(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長繁殖與若干癌基因和抑癌基因的表達(dá)異常有關(guān)，其中重要的有Survivin和紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白(KSP) 基因。Survivin基因是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成員，具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及抗凋亡的能力，高表達(dá)于各種惡性腫瘤組織及胚胎組織，如乳癌組織[1]，而在正常組織(胸腺、生殖器除外)細(xì)胞中水平較低或不表達(dá)。KSP是驅(qū)動(dòng)蛋白5亞家族中的一員[2]，在細(xì)胞有絲分裂早期，對雙極紡錘體的形成、復(fù)制、染色體的分離和中心體的分裂等有絲分裂過程起著重要的作用[3]。除此之外，KSP還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，在很多腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)(如乳癌[4])，已成為近年一個(gè)重要的腫瘤化療的新靶點(diǎn)[5]。理論上，抑制高表達(dá)的癌基因，就可抑制癌細(xì)胞的增殖或使其凋亡。小干擾RNA(siRNAs)技術(shù)具有特異性高、效果好、制備容易、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已成為抑制基因表達(dá)的首選方法。本研究擬通過聯(lián)合轉(zhuǎn)染Survivin和KSP 的siRNAs，抑制這兩種基因在乳癌細(xì)胞中的表達(dá)，探討其對細(xì)胞生長能力、侵襲能力的影響，為乳癌的基因治療提供新策略。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人乳癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑 脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人Survivin、KSP多克隆抗體購自美國Biolengend公司；β-actin一抗和二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；特異性靶向Survivin、KSP基因及scramble的siRNAs由上海吉瑪公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳癌細(xì)胞株MDA-MB-231經(jīng)復(fù)蘇后，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度為4×108/L、細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)分組如下：空白對照組(A組)，陰性對照組(B組，轉(zhuǎn)染scramble siRNAs)，Survivin轉(zhuǎn)染組(C組)，KSP轉(zhuǎn)染組(D組)，Survivin+KSP轉(zhuǎn)染組(E組，轉(zhuǎn)染Survivin和KSP的siRNAs各半)。轉(zhuǎn)染siRNAs的終濃度均為100 nmol/L。將配制的siRNAs-LipofectamineTM2000混和液加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，使每孔總體積為2 mL，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察siRNAs抑制效果。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1.5×107/L；置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，各組加入終濃度為100 nmol/L的相應(yīng)siRNAs；分別在轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，每孔加入新鮮配制的10 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min；用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長490 nm處測定每孔吸光度(A)值，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作空白對照，最后結(jié)果取3個(gè)平行孔的均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染后72 h收集106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌，1 000 r/min離心3 min，反復(fù)3次。棄上清液，收集細(xì)胞，混勻沉淀，快速加入體積分?jǐn)?shù)0.75的冷乙醇中，4 ℃固定24 h，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以流式四象限散點(diǎn)圖表示，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。

1.2.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol試劑提取各組的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA鏈的合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40個(gè)循環(huán)。以A組mRNA的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其他組mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果以2-△△CT表示。qRT-PCR所用引物名稱及其序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物名稱及其序列

1.2.6 蛋白印跡法檢測Survivin和KSP蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行濃度測量，取50 μg蛋白置100 g/L SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶200稀釋的兔抗人Survivin、KSP一抗，室溫作用3 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG/HRP，室溫溫育1 h，TBST洗膜，DAB顯色。以β-actin為內(nèi)參，用quantity one軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算Survivin和KSP蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNAs對MDA-MB-231細(xì)胞增殖影響

與A組相比，各siRNAs組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率均有所下降，以E組下降最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 307.81～3 674.31,P<0.01)。E組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞增殖率較轉(zhuǎn)染24 h顯著下降(F=7.203，P<0.01)，但轉(zhuǎn)染48 h與轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞增殖率差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.2 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

A、B組細(xì)胞形態(tài)良好，呈梭狀，兩組差異不明顯；C、D組凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞變圓，且兩組細(xì)胞凋亡數(shù)目無明顯差異；E組細(xì)胞凋亡最顯著，圓形細(xì)胞增多。見圖1。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNAs對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡影響

轉(zhuǎn)染后72 h，C、D、E組細(xì)胞的凋亡率分別為(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%和(45.73±1.11)%，各組細(xì)胞凋亡率高于A組(5.29±0.09)%和B組(5.17±0.032)%，且以E組的細(xì)胞凋亡率最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 450.76，P<0.01)；A組與B組細(xì)胞凋亡率差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 轉(zhuǎn)染siRNAs對相關(guān)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

A、B組細(xì)胞Survivin、KSP、Bax和Bcl-2基因mRNA的表達(dá)比較差異無顯著意義(P>0.05)；與A組相比較，C、E組Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(F=299.70、490.20，P<0.01)，D、E組KSP mRNA和蛋白的表達(dá)水平也明顯降低(F=76.64、48.68，P<0.01)，C、D、E組Bax mRNA的表達(dá)水平明顯升高(F=65.73，P<0.01)，C、D、E組Bcl-2 mRNA的表達(dá)則顯著減少(F=27.41，P<0.01)。以上各指標(biāo)檢測結(jié)果均以E組變化最為明顯。見表3。

表2 各組細(xì)胞增殖率的比較

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：Survivin轉(zhuǎn)染組；D：KSP轉(zhuǎn)染組；E：Survivin+KSP轉(zhuǎn)染組。100倍。

表3 各組相關(guān)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

近半個(gè)世紀(jì)以來，隨著工業(yè)化的發(fā)展，乳癌發(fā)病率和死亡率一直呈明顯的上升趨勢，但目前還沒有完全有效的藥物治療乳癌。越來越多的研究表明，siRNAs技術(shù)能有效抑制癌細(xì)胞的增殖。因此，尋找有效的siRNAs靶位點(diǎn)可能會(huì)成為最熱門的癌癥治療手段之一。

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的惟一與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控均相關(guān)的IAP家族成員。Survivin在細(xì)胞周期的G2/M期特異性表達(dá)，在細(xì)胞有絲分裂期間，它通過特異性結(jié)合到紡錘體的微管蛋白上來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞分裂的調(diào)控[6]。因此，Survivin對維持快速增殖細(xì)胞的存活、腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及其分化具有重要功能[7]。一些研究指出，Survivin主要通過抑制半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-9的活性，阻斷各種刺激因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[8-10]，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤血管生成[11]。下調(diào)Survivin后可以上調(diào)Bax和BAD的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。本文研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染靶向Survivin的siRNAs，可有效下調(diào)Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平。隨著Survivin表達(dá)的下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bax的表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞凋亡程度明顯增高。本文的研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，說明我們所設(shè)計(jì)合成的Survivin siRNAs可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

KSP具有驅(qū)動(dòng)蛋白家族保守的ATP酶結(jié)構(gòu)域和動(dòng)力結(jié)構(gòu)域，在有絲分裂前中期，對雙極紡錘體的形成分離過程有重要的作用[15]。有研究顯示，針對KSP的siRNAs能夠?qū)е聠涡菭罴忓N體的產(chǎn)生，促使有絲分裂阻滯在M期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。也有研究表明，KSP高表達(dá)于人體惡性增殖的組織細(xì)胞中，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖指數(shù)、有絲分裂比例及腫瘤的生長速度有相關(guān)性[17]。KSP蛋白參與細(xì)胞的有絲分裂，人體正常分裂增殖的組織細(xì)胞中也存在KSP的表達(dá)，但其表達(dá)水平明顯低于惡性組織；在人體正常分化成熟的組織細(xì)胞中，如神經(jīng)細(xì)胞中未檢測到KSP的表達(dá)[18]。因此，抑制KSP能夠抑制細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞停止增殖。本研究使用siRNAs抑制KSP表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，這表明下調(diào)KSP表達(dá)可有效抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TAO等[19]的研究表明，抑制KSP可以激活Bax、caspase3等凋亡基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果顯示，下調(diào)KSP表達(dá)可以提高Bax/Bcl-2的比值[20]。本研究結(jié)果與之相符。

在大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤組織中，包括乳癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肺癌，Survivin和KSP的表達(dá)均上調(diào)，與腫瘤的惡性行為相關(guān)[21]。因此，越來越多的研究將Survivin和KSP作為癌癥治療的靶位點(diǎn)。目前，KSP siRNAs和血管內(nèi)皮生長因子siRNAs聯(lián)合干擾已經(jīng)用于人體研究，效果顯著[21]。然而，目前還未見同時(shí)靶向Survivin和KSP的siRNAs對乳癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲影響的研究報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用化學(xué)合成的siRNAs，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)特異性抑制Survivin和KSP基因的表達(dá)。本文的研究結(jié)果顯示，雙干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于單干擾組。同樣，Survivin和KSP的表達(dá)在雙干擾組降低最顯著。

綜上所述，利用siRNAs同時(shí)下調(diào)Survivin和KSP基因的表達(dá)，抑制乳癌細(xì)胞的生長效果顯著高于單獨(dú)下調(diào)任何一種基因的表達(dá)；Survivin和KSP可以作為腫瘤治療的兩個(gè)重要靶標(biāo)；聯(lián)合下調(diào)Survivin和KSP可作為乳癌治療的參考。本文結(jié)果為多基因共沉默抑制腫瘤細(xì)胞的生長提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為利用siRNAs進(jìn)行腫瘤基因治療提供了有意義的嘗試。

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(本文編輯 馬偉平)

EFFECTS OF COMBINED DOWN REGULATION OF EXPRESSIONS OF SURVIVIN AND KSP ON APOPTOSIS OF BREAST CAN-CER CELL MDA-MB-231

ZHANGFengying,QIAOLijun,ZHANGJinyu,XUEMeilan,GEYinlin

(Department of Biochemistry, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined down regulation of expressions of Survivin and kinesin spindle protein (KSP) on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells (MDA-MB-231).MethodsSmall interfering RNAs (siRNAs) targeting Survivin and KSP mRNA were chemically synthesized and jointly or separately transfected to breast cancer cells (MDA-MB-231). A blank control group was served as negative control. Employing MTT method to measure the cell proliferation rate, qRT-PCR to detect the expressions of Survivin, KSP, Bax and Bcl-2 mRNA, Western blotting to detect the expressions of Survivin and KSP proteins, and flow cytometry to detect the cell apoptosis.ResultsAfter 48 hours of transfection, the cell proliferation rates in Survivin, KSP and Survivin+KSP groups were 0.66±0.01, 0.67±0.03, and 0.54±0.01, respectively, and the apoptotic rates were (11.61±0.89)%, (16.33±0.94)%, and (45.73±1.11)%, respectively, the differences were statistically significant as compared with the blank control group (F=1 307.81,1 450.76;P<0.01), of which, the lowest rate of cell proliferation and the highest rate of apoptosis were noted in double-interference group. In each transfection group, the mRNA and protein expressions of Survivin and KSP were significantly declined (F=48.68-490.20,P<0.01), the expression of Bax mRNA increased (F=65.73,P<0.01), and the mRNA expression of Bcl-2 reduced (F=27.41,P<0.01).ConclusionApplyingsiRNAs to jointly down regulation of both Survivin and KSP expressions can more effectively inhibit the proliferation and promote apoptosis of breast cancer cells than down-regulating the expression of individual gene.

breast neoplasms; inhibitor of apoptosis proteins; kinesin; RNA interference

2015-01-22;

2015-06-06

青島市科技局科研基金資助項(xiàng)目(07-2-1-7-nsh)

張鳳英(1973-)，女，碩士研究生，講師。

葛銀林(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。

R737.9

A

1008-0341(2015)04-0402-05