吳桐，張翠萍，梁坤，趙坤，張琪，田字彬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 感染科)

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Hippo信號(hào)通路在結(jié)直腸黏膜癌變過(guò)程中的作用

吳桐1，張翠萍1，梁坤2，趙坤1，張琪1，田字彬1

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 感染科)

目的 探討Hippo信號(hào)通路的核心組件哺乳動(dòng)物絕育20樣激酶1(MST1)和Yes相關(guān)蛋白(YAP)在結(jié)直腸黏膜癌變過(guò)程中的作用。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中MST1和YAP mRNA的表達(dá)水平；應(yīng)用免疫印跡法，檢測(cè)3種組織中MST1和YAP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果MST1在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.425、125.092，P<0.05)。YAP在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組間差異有顯著意義(F=40.775、181.187，P<0.05)。MST1與YAP1在所有組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.399、-0.644，P<0.01)。結(jié)論 Hippo信號(hào)通路可能在結(jié)直腸黏膜癌變過(guò)程中起關(guān)鍵作用，該通路可為結(jié)直腸癌的預(yù)防、治療和預(yù)后判斷提供新的靶向指導(dǎo)。

結(jié)直腸腫瘤；哺乳動(dòng)物絕育20樣激酶1；原癌基因蛋白質(zhì)c-yes

多年來(lái)，世界上多數(shù)國(guó)家結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]，我國(guó)新發(fā)病例每年以4%的比例增加，目前結(jié)直腸癌占所有惡性腫瘤的第3～5位[2]，上海市2008年更是升至第2位。近年來(lái)，結(jié)腸鏡的廣泛應(yīng)用使得早期結(jié)直腸癌的發(fā)現(xiàn)逐漸增加，結(jié)直腸癌病人生存率逐年提高。大約85%的結(jié)直腸癌源于腺瘤性息肉，故腺瘤性息肉被認(rèn)為是癌前疾病。目前被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的演變過(guò)程為正常腸上皮→過(guò)度增生上皮→結(jié)直腸腺瘤→結(jié)直腸癌，此發(fā)展過(guò)程大約需要10年。結(jié)直腸惡性腫瘤的發(fā)生與結(jié)直腸細(xì)胞過(guò)度增殖、分化異常及細(xì)胞凋亡等多種因素密切相關(guān)，是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異積累以及相互作用的復(fù)雜過(guò)程，與體內(nèi)多種信號(hào)通路表達(dá)異常相關(guān)。Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的抑癌通路，它在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡過(guò)程中起著極其重要的調(diào)控作用[3]。Hippo信號(hào)通路有多種重要調(diào)控因子，其中哺乳動(dòng)物絕育20樣激酶1(MST1)和Yes相關(guān)蛋白(YAP)在正常組織細(xì)胞向癌細(xì)胞發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。已有研究證實(shí)，MST1的表達(dá)直接決定了YAP的定植，從而決定正常細(xì)胞是否向惡性腫瘤方向發(fā)展[4]。本研究旨在探討Hippo信號(hào)通路的核心組件MST1和YAP在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及病人同意，選取30例結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織，均取自2013年于我院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌病人；選取30例結(jié)直腸

腺瘤組織，均取自我院行電子結(jié)腸鏡檢查并行鏡下息肉切除術(shù)的病人。結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤均經(jīng)病理檢查證實(shí)。結(jié)直腸癌病人手術(shù)前均未接受放化療，癌旁正常組織為距離癌組織邊緣>5 cm的結(jié)直腸黏膜組織。組織離體后立即置液氮中暫存，隨后將組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)MST1和YAP mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑盒提取組織總RNA，并進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。選用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。PCR引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20.0 μL：SYBR Premix 10.0 μL，上游引物1.6 μL，下游引物1.6 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線得到CT值，結(jié)果以2-△△CT表示。Trizol試劑盒、TaKaRa Pri-merScriptTMRT、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自大連寶生物公司，氯仿、異丙醇購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

1.2.2 免疫印跡法檢測(cè)MST1和YAP蛋白的表達(dá)在低溫條件下應(yīng)用BCA試劑盒提取組織總蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)562 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，β-actin兔抗人一抗、MST1兔抗人一抗、YAP兔抗人一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自Abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MST1、YAP mRNA在各組織中的表達(dá)

MST1 mRNA在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，各組間差異有顯著性(F=13.425，P<0.05)；YAP mRNA在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組間差異有顯著性(F=40.775，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 MST1、YAP蛋白在各組織中的表達(dá)

MST1蛋白在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，各組間差異有顯著性(F=125.092，P<0.05)；YAP蛋白在癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組間差異有顯著意義(F=181.187，P<0.05)。與結(jié)直腸癌組織相比，結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織中MST1蛋白的表達(dá)分別上升了37.3%和71.2%，YAP的表達(dá)分別下降了29.5%和51.3%。見(jiàn)表2、圖1。

2.3 所有組織中MST1與YAP1表達(dá)的相關(guān)性

所有組織中MST1與YAP1 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.399、-0.644，P<0.01)。

表2 MST1和YAP在各組織中的表達(dá)

A：癌旁正常組織，B：結(jié)直腸腺瘤組織，C：結(jié)直腸癌組織。

3 討 論

內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)于機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在著多種細(xì)胞信號(hào)通路，其在維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡方面扮演著極其重

要的角色。各通路一旦失活，就會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和(或)抑制細(xì)胞凋亡，最終引起細(xì)胞發(fā)生惡變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。

Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)通路。作為一種抑癌通路，該通路主要在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控器官大小方面發(fā)揮作用[6]。Hippo信號(hào)通路首先在黑腹果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，研究者對(duì)該通路施予外在干預(yù)后，觀察到果蠅的眼睛和翅膀大小發(fā)生變化，證實(shí)Hippo通路的作用之一是影響細(xì)胞增殖過(guò)程[7]。Hippo信號(hào)通路是高度保守的生長(zhǎng)控制通路，其在哺乳動(dòng)物中主要由MST、Lats、YAP等因子構(gòu)成[8]。研究證實(shí)，MST直接對(duì)YAP起調(diào)控作用：MST基因失活后，該通路下游靶基因YAP即被激活，激活后的YAP促進(jìn)通路中下游因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、解除接觸抑制和促進(jìn)腫瘤發(fā)生[9]。

MST1是Hippo信號(hào)通路中上游信號(hào)分子之一，與果蠅體內(nèi)hpo蛋白激酶都屬于STE蛋白激酶家族成員[10]。MST1分子結(jié)構(gòu)中，N末端含有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，C末端包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域即為SARAH結(jié)構(gòu)域。正常機(jī)體的細(xì)胞增殖過(guò)度時(shí)，MST基因激活，編碼的MST蛋白會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程，維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定。相關(guān)研究證實(shí)，MST通過(guò)MST1(Thr183)/2(Thr180)位點(diǎn)發(fā)生自身磷酸化，然后進(jìn)一步地活化Lat1/2，Lat1/2磷酸化后使YAP失活，失活后的YAP被留置于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并與14-3-3蛋白結(jié)合，最終被降解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，阻止細(xì)胞過(guò)度增殖[11]。磷酸化的Lat1/2同時(shí)也會(huì)激活SAPK、Jnk及P53等信號(hào)通路，最終結(jié)果都是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。CINAR等[13]的研究顯示，MST基因缺失后，前列腺細(xì)胞會(huì)向惡性細(xì)胞發(fā)展。本研究結(jié)果表明，不論是在mRNA還是在蛋白表達(dá)水平上，結(jié)直腸癌組織MST1的表達(dá)量均明顯低于結(jié)直腸腺瘤與癌旁正常組織，結(jié)直腸腺瘤組織MST1的表達(dá)水平介于癌旁正常組織和結(jié)直腸癌組織之間，表明腸黏膜細(xì)胞在惡變過(guò)程中Hippo信號(hào)通路中的MST基因是受到抑制的，并且結(jié)直腸腺瘤中MST基因在一定程度上也處于抑制狀態(tài)。

YAP是Hippo信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子，與果蠅體內(nèi)Yki蛋白同源，有相似的生物學(xué)活性。YAP具有致癌活性，其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。正常情況下，YAP受通路上游因子的影響發(fā)生磷酸化，磷酸化后的YAP積聚于細(xì)胞漿內(nèi)，通過(guò)磷酸化的ser127與14-3-3蛋白結(jié)合，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制細(xì)胞增殖。而在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，YAP失去上游因子的控制，無(wú)法磷酸化，非磷酸化的YAP進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子TAZ形成YAP-TAZ復(fù)合體，進(jìn)而與TEA功能域轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白Cycling E表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。并且，非磷酸化的YAP還可以誘導(dǎo)凋亡調(diào)控因子cIAPI表達(dá)增加，抑制細(xì)胞增殖[14]。已證實(shí)YAP蛋白過(guò)度表達(dá)和(或)在細(xì)胞核內(nèi)過(guò)度蓄積在多種惡性腫瘤中存在，如肝癌、胃癌、乳癌、肺癌及前列腺癌等[15]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織YAP的表達(dá)水平較正常腸黏膜與結(jié)直腸腺瘤組織顯著升高，表明腸黏膜細(xì)胞在從結(jié)直腸腺瘤向結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程中，Hippo信號(hào)通路中的YAP蛋白磷酸化受到了抑制，非磷酸化的YAP蛋白相對(duì)增多，后者無(wú)法被留置于細(xì)胞漿內(nèi)，而是進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，最終引起惡性腫瘤發(fā)生。

另外，本研究結(jié)果顯示，同一標(biāo)本中，不論是癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤組織，還是結(jié)直腸癌組織，MST1與YAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與之前有關(guān)研究的結(jié)果一致[16]。并且本研究結(jié)果呈現(xiàn)出隨著疾病嚴(yán)重程度進(jìn)展，這種負(fù)相關(guān)程度減弱的趨勢(shì)，表明在結(jié)腸黏膜細(xì)胞惡變過(guò)程中，MST對(duì)YAP的負(fù)向調(diào)控作用逐漸減弱。

總之，在結(jié)直腸黏膜癌變過(guò)程中，Hippo信號(hào)通路發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用。而檢測(cè)MST1和YAP，為闡明結(jié)直腸黏膜發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化提供了新的分子機(jī)制，也為未來(lái)結(jié)直腸癌的早期預(yù)防及基因治療提供了新的靶向治療措施。

[1] JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al. Cancer statistics, 2008[J]. CA Cancer J Clin, 2008,58(2):71-96.

[2] 梁晨,韓盛璽,王晉萍. 辣椒素對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株增殖作用的影響[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2011,26(1):11-12,16.

[3] ZHAO B, LEI Q Y, GUAN K L. The Hippo-YAP pathway: new connections between regulation of organ size and cancer[J]. Curr Opin Cell Biol, 2008,20(6):638-646.

[4] 張紅珠,張翠萍,張琪,等. MST1與YAP1在食管疾病中的表達(dá)及意義[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014,50(1):62-63,67.

[5] PAN D. Adjuvant capecitabine and oxaliplatin for gastric cancer after D2 gastrectomy(CLASSIC): a phase 3 open-label, randomized controlled trial[J]. Lancet, 2012,379(9813):315-321.

[6] ZHENG T, WANG J, JIANG H, et al.

Hippo signaling in oval cells and hepatocarcinogenesis[J]. Cancer Lett, 2011,302(2):91-99.

[7] BADOUEL C, GARG A, MCNEILL H. Herding hippos: re-gulating growth in flies and man[J]. Curr Opin Cell Biol, 2009,21(6):837-843.

[8] ZENG Q, HONG W. The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer deve-lopment in mammals[J]. Cancer Cell, 2008,13(3):188-192.

[9] YU F X, ZHAO B, PANUPINTHU N, et al. Regulation of the Hippo-YAP pathway by g-protein-coupled receptor signaling[J]. Cell, 2012,150(4):780-791.

[10]MORINAKA A, FUNATO Y, UESUGI K, et al. Oligomeric peroxiredoxin-Ⅰ is an essential intermediate for p53 to activate MST1 kinase and apoptosis[J]. Oncogene, 2011,30(40):4208-4218.

[11]WANG L, SHI S, GUO Z, et al. Overexpression of YAP and TAZ is an independent predictor of prognosis in colorectal cancer and related to the proliferation and metastasis of colon cancer cells[J]. PLoS One, 2013,8(6): e65539.

[12]AVRUCH J, ZHOU D, FITAMANT J, et al. Mst1/2 signalling to Yap: gatekeeper for liver size and tumour development[J]. Br J Cancer, 2011,104(1):24-32.

[13]CINAR B, COLLAK F K, LOPEZ D, et al. MST1 is a multifunctional caspase-independent inhibitor of androgenic signaling[J]. Cancer Res, 2011,71(12):4303-4313.

[14]LI Z, ZHAO B, WANG P, et al. Structural insights into the YAP and TEAD complex[J]. Genes Dev, 2010,24(3):235-240.

[15]ZENDER L, SPECTOR M S, XUE W, et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach[J]. Cell, 2006,125(7):1253-1267.

[16]LIU A M, POON R T, LUK J M. MicroRNA-375 targets Hippo-signaling effector YAP in liver cancer and inhibits tumor properties[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,394(3):623-627.

(本文編輯 馬偉平)

EFFECT OF HIPPO PATHWAY ON THE PROCESS OF COLORECTAL MUCOSA CARCINOGENESIS

WUTong,ZHANGCuiping,LIANGKun,ZHAOKun,ZHANGQi,TIANZibin

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Hippo pathway components-mammalian sterile 20-like kinase 1 (MST1) and Yes associated protein (YAP)-on the process of mucosa carcinogenesis in colon and rectum.MethodsEmploying real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), the expressions of mRNA of MST1 and YAP in paraneoplastic normal intestinal tissue, colorectal adenoma, and colorectal cancer were detected, and using Western blot method, the expressions of MST1 protein and YAP protein in three kinds of the tissues were measured.ResultsThe MST1 mRNA expression presented a decreasing tendency in normal paraneoplastic tissue, colorectal adenoma and colorectal cancer, the difference between each group was significant (F=13.425,125.092;P<0.05). And the YAP mRNA expression in the above three kinds of the tissues showed an increasing tendency, the difference between each group was significant (F=40.775,181.187;P<0.05). The expression of MST1 in all the tissues was negatively correlated with YAP expression (r=-0.399,-0.644;P<0.01).ConclusionHippo signal pathway may play a key role in the development from colorectal adenoma to colorectal cancer, which provides a new target guidance for prevention, therapy and prediction of prognosis of this malignancy.

colorectal neoplasms; mammalian sterile 20-like kinase 1; proto-oncogene proteins c-yes

2015-01-15;

2015-05-28

吳桐(1989-)，女，碩士研究生。

張翠萍(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

R735.3

A

1008-0341(2015)04-0459-04