李雪蘭 黃新蘭* 翟 艷 趙愛華 葉紅芳 陳琴華

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是藥品一個(gè)非常重要的安全指標(biāo)，輸液導(dǎo)致熱原超標(biāo)是輸液反應(yīng)的主要原因[1]，近年來，世界各國(guó)越來越多地以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔熱原法檢查藥品和生物制品的致熱物質(zhì)越來越普遍。脂肪乳注射液是靜脈營(yíng)養(yǎng)的組成部分之一，為機(jī)體提供能量和必需脂肪酸，用于胃腸外營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充能量及必需脂肪酸，預(yù)防和治療人體必需脂肪酸缺乏癥，也為經(jīng)口服途徑不能維持和恢復(fù)正常必需脂肪水平的病人提供必需脂肪酸?！吨袊?guó)藥典》2005年版尚未收載該品種。為此，特對(duì)脂肪乳注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

1 儀器與試藥

2H-2型漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；DC3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司）；LC-233B1型高溫干燥箱。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：150601-200860，160EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物制品有限公司，批號(hào)：0904100）；鱟試劑（TAL，湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.125EU/mL，批號(hào)：0901120），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.125EU/mL，批號(hào)：0905311）脂肪乳注射液，（規(guī)格：100mL∶20g（大豆油）：1.2g卵磷脂，批號(hào)：09072301、09072302、09072401）揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L確定

公式L=K/M中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值；K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5EU/（kg?h）[1]；M為每小時(shí)內(nèi)每千克體質(zhì)量（人）的最大給藥劑量，或熱原檢查家兔按規(guī)定給藥途徑的給藥劑量，考慮到本品的熱原劑量為10mL/kg，因此可算得L=5/10=0.5EU/mL。

2.2 最大有效稀釋倍數(shù)的確定

根據(jù)公式MVD=cL/λ，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標(biāo)示敏感度。2005年版《中國(guó)藥典》規(guī)定當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，c為1.0mL/mL。L=0.5EU/mL，λ為0.125EU/mL，則MVD=4。

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）的質(zhì)量考察

實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量＜0.015EU/mL）經(jīng)檢查，在37℃試管恒溫儀中放置4h未與鱟試劑產(chǎn)生凝聚反應(yīng)，符合中國(guó)藥典規(guī)定[2]。

2.4 TAL敏感度復(fù)核

所用TAL按2005年版《中國(guó)藥典》規(guī)定進(jìn)行敏感度復(fù)核。結(jié)果均在0.5～2λ，符合規(guī)定，故可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

2.5 干擾預(yù)試驗(yàn)

選用λ＝0.125EU/mL的TAL，以原液作為基準(zhǔn)，用BET水對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋，得樣品的稀釋倍數(shù)系列（即原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16），以此系列為NC系列。PC系列：用原液和供試品各稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成與上述NC系列相同的稀釋倍數(shù)系列，但在稀釋過程中每稀釋倍數(shù)中都會(huì)有2λ內(nèi)毒素。選擇兩個(gè)廠家的標(biāo)示量為0.125EU/mL的TAL，使之分別與上述兩個(gè)系列反應(yīng)，同時(shí)作陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：樣品溶液稀釋倍數(shù)在1∶2以下時(shí)不干擾試驗(yàn)。

表1 供試品干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.6 干擾試驗(yàn)

采用兩個(gè)廠家0.125EU/mL的TAL，用脂肪乳液注射液的1∶2稀釋液和BET水將同一細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列濃度溶液，考察本品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的干擾情況，結(jié)果見表2。Es值在0.5～2.0λ，且Et值在0.5Es～2.0 Es，說明此時(shí)樣品稀釋對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

2.7 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2005年版《中國(guó)藥典（二部）》附錄規(guī)定的方法，對(duì)3批樣品按1∶4稀釋后，以λ為0.125EU/mL的TAL進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3批脂肪乳注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素均＜0.25EU/mL，結(jié)果符合規(guī)定。

3 討 論

本試驗(yàn)采用不同廠家的TAL對(duì)3個(gè)批號(hào)樣品進(jìn)行凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果符合2005年版《中國(guó)藥典》附錄有關(guān)規(guī)定，排除了采用了不同廠家TAL對(duì)本試驗(yàn)帶來的影響，使用λ為0.125 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的，確證了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法完全可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兔熱原法用于該制劑的質(zhì)量控制。據(jù)此提出脂肪乳注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查參考此標(biāo)準(zhǔn)：取本品，依照《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄XIE檢查，每1ml中含有內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU/mL[3]。

表2 供試品的干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3 3批脂肪乳注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005: XIE 86.

[2]葉明,紀(jì)綠波.細(xì)菌內(nèi)毒素及其檢查法的研究[J].廣東藥學(xué),2003,13(2): 28-29.

[3]陳衛(wèi).中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(C8-24Ve)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國(guó)臨床醫(yī)藥研究雜志,2008,192 (12):2-4.