管 峰 石國慶 趙 進 楊利國

（1.中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室,石河子 832000; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點試驗室,武漢 430070）

朊蛋白（p rion proteins,PrP）是近年來確認(rèn)的引起人畜共患病的一種蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)具有自我復(fù)制和傳播能力,尤其在英國“瘋牛病”事件以后,對PrP的研究受到世界各國的重視。PrP空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是可傳播性海綿狀腦?。╰ransmissible spongiform encephalopathie,TSE）的根源,該病導(dǎo)致患病動物大腦中大量神經(jīng)細胞死亡并出現(xiàn)海綿狀空泡化且具有一定傳染性。反芻動物乳及加工后的乳制品中存在PrP,因此其潛在威脅備受人們的重視并對此開展了許多研究。

本文從PrP的基本特征、生理功能、乳及乳制品中PrP的來源和含量以及安全性評價等方面進行簡述,以便為乳品安全和乳用動物的育種研究提供理論參考。

1 PrP特征及相關(guān)疾病

PrP是一類小分子疏水性糖蛋白,在理化性質(zhì)上與普通蛋白質(zhì)存在較大差別。PrP對化學(xué)試劑與生化試劑等表現(xiàn)出強抗性,對諸多物理因素如80～100℃高溫均有相當(dāng)?shù)哪褪苣芰1]。PrP是由動物單一PrP基因（prion p ro tein gene,PRNP）編碼的大小約250個氨基酸的蛋白質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達,在非神經(jīng)系統(tǒng)少量或微量表達,且在不同物種中高度保守,DNA和氨基酸序列的相似性分別達到90%和95%以上[2]。人類和小鼠的PRNP分別定位于20號和2號染色體[3],綿羊和牛PRNP均定位于13號染色體[4-5]。

細胞PrP（PrPC）因空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為致病PrP （PrPSc）而導(dǎo)致PrP疾病,但這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變機制尚不完全清楚。細胞PrP對生物體的生理作用尚不完全清楚,推測在神經(jīng)元營養(yǎng)與功能維持、保護活性氧誘導(dǎo)的DNA損傷、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Cu2+、Ca2+代謝等方面具有重要功能[6-7]。有研究認(rèn)為,TSE發(fā)病是因為細胞PrP正常神經(jīng)保護作用喪失,大腦中細胞PrP嚴(yán)重減少所致[8]。研究證明,在PRNP敲除小鼠大腦部位蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化水平顯著升高,加上此時缺乏抗氧化酶的大腦環(huán)境還要承受較強的氧化作用（吸入氧的20%）,因此易于發(fā)生氧化損傷;反之證明,抗氧化能力強的細胞系都具有較高的細胞PrP表達水平,高表達的細胞PrP可以修復(fù)氧化應(yīng)激造成的DNA損傷,減少神經(jīng)變性疾病發(fā)生[9-10]。

PrP疾病是一類神經(jīng)退行性疾病的總稱,主要包括羊的癢?。╯crapie）、牛海綿狀腦?。˙SE,即“瘋牛病”）、人庫魯氏?。↘uru）、克雅氏?。–JD）、格斯特曼綜合癥（GSS）、家族致死性失眠綜合癥（FFI）和新型克雅氏?。╲CJD）等。流行病學(xué)研究認(rèn)為,TSE的傳播與來自感染的動物源性物質(zhì)尤其與BSE感染的肉骨粉等材料有關(guān),也是人類新型克雅氏病的潛在致病源[11]。

2 乳及乳制品中PrP的含量

乳及乳制品是人類攝入蛋白質(zhì)的重要來源之一,與人類的生活關(guān)系極為密切。乳及乳制品中PrP的安全性直接關(guān)系到人類的健康,甚至生命安全。因此,對乳及乳制品中PrP的檢測也就隨之成為人們研究的熱點。鑒于PrP在血液組織中的存在,推測可能在乳中存在來自血細胞或者乳腺上皮細胞的PrP。但是,由于技術(shù)的限制,乳中高含量的總蛋白（約40mg/L）和大量脂類物質(zhì)（約35mg/L）的存在限制了原有的生化方法對PrP進行有效的檢測,只能在血細胞成分中檢測到細胞PrP和病變PrP的存在,直到2006年尚不能對乳中PrP進行定性檢測[12]。

隨著蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用免疫組化、免疫沉淀、蛋白質(zhì)雜交和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附）等綜合方法,證明在反芻動物乳和乳腺細胞中PrP的表達具有種類特異性,其含量在牛、綿羊和山羊的乳腺、脫脂乳、乳清蛋白以及乳酪中存在差異,PrP相對含量最高的是乳酪,且乳中PrP具有和近似神經(jīng)組織中PrP全長的序列和結(jié)構(gòu)特征[13-14]。對山羊乳的研究證明,乳中PrP相對神經(jīng)組織PrP電泳遷移率增加[14]。蛋白質(zhì)雜交研究表明,山羊和綿羊乳中所有PrP均含有分子量12 ku的組分,且這一分子量縮短的PrP在山羊乳清蛋白中是優(yōu)勢蛋白質(zhì)[13]。

Franscini等[12]通過一種特異性吸附劑結(jié)合并濃縮細胞PrP和病變PrP的方法,分別對10m L牛乳、綿羊乳、山羊乳和人乳中的PrP進行雜交檢測,在牛乳中檢測到3個亞型,分子量分別為34、30和27 ku,并分別對應(yīng)雙糖基化、單糖基化和非糖基化PrP。最小的非糖基化PrP的分子量高于重組牛PrP分子量（26 ku）,這是因為天然PrP帶有一個糖基化磷脂?；煎^定位點。綿羊乳、山羊乳和人乳中PrP總量差異很大,但基本分子量分布和牛乳相似。對乳中PrP定量研究表明,PrP在鮮牛乳中的總含量為200 pg/m L,鮮綿羊乳和山羊乳中PrP含量分別約為1 ng/m L和40 pg/m L,人乳中則少于10 pg/m L。PrP在綿羊乳、牛乳、山羊乳和人乳中的含量比約為100∶20∶4∶1。在經(jīng)過巴氏消毒和超高溫消毒加工后的牛乳中仍能很清楚的檢測到PrP的存在,含量和山羊乳相當(dāng),而綿羊乳在稀釋4倍后含量仍為山羊乳的10多倍[12]。

3 乳及乳制品中PrP的來源

一般來說,健康乳用動物如奶牛所產(chǎn)的正常乳中都含有一定數(shù)量的體細胞,但是一般均低于2× 105個/m L,這是動物乳腺自身免疫的需要[15]。這些細胞多是來自白細胞,包括巨噬細胞、嗜中性白細胞和淋巴細胞（約占98%）,其他則來自于乳腺組織脫落的上皮細胞[12,16]。當(dāng)動物受到外界或自身因素影響,乳腺感染后由于白細胞的吞噬作用會引起乳中細胞數(shù)量增加。一般來說,乳中PrP的來源有以下幾種途徑:乳腺上皮細胞的胞外分泌;乳球蛋白的分泌;血清和間質(zhì)細胞蛋白質(zhì)的跨膜作用和血漿成分以及粒細胞的分泌作用[14]。最新研究顯示牛乳腺細胞中PrP在乳腺上皮細胞選擇定位,主要分布于分泌活性較高的基底細胞表面[17]。乳腺細胞中乳球蛋白的分泌模式是PrP進入乳中的主要途徑[12]。

由于PrP特殊的物理和化學(xué)性質(zhì),乳制品的加工一般不會影響乳中PrP的結(jié)構(gòu),但多數(shù)因為稀釋而使含量降低。市售的全脂乳、半脫脂乳和脫脂乳均有PrP存在,但含量比鮮乳有所下降,兒童配方奶粉中PrP含量很低甚至在目前的檢測限度以下[14]。

4 乳及乳制品中PrP的安全性

有關(guān)乳及乳制品的安全性研究始于20世紀(jì)60年代,多年來由于一直未能在染病動物乳中找到傳播因子的存在,研究人員因此認(rèn)為乳及乳制品都是安全的[18]。在早期研究中,Vetrugno等[19]用“瘋牛病”奶牛所產(chǎn)的乳以口服（每只每天30m L）、腦內(nèi)注射（每只每天0.02 m L）或者腹腔注射（每只每天0.10 m L）方式給小鼠,經(jīng)過2年的觀察未發(fā)現(xiàn)任何臨床癥狀和神經(jīng)損傷,通過飼喂小鼠含有病變PrP的牛乳,也未發(fā)現(xiàn)牛乳傳播的證據(jù)[14]。另外,在人類飲用牛乳的跟蹤調(diào)查中也沒有觀察到感染人的現(xiàn)象,因此認(rèn)為牛乳以及相關(guān)乳制品不具有感染性[20]。此外,世界上所有權(quán)威機構(gòu)都投入精力對此進行了研究,包括世界衛(wèi)生組織、國際獸醫(yī)組織、歐盟委員會、英國海綿狀腦病咨詢委員會和美國農(nóng)業(yè)部,研究人員也一致認(rèn)為牛乳是安全的,美國甚至沒有禁止從“瘋牛病”疫區(qū)進口乳制品[21]。與此相反的是,羊瘙癢病卻廣泛傳播,在這種情況下研究人員又不得不懷疑同時患有乳腺炎的患病羊的乳是否會造成污染[22]。這一時期,“瘋牛病”傳播并導(dǎo)致人類感染新型克雅氏病的證據(jù)伴隨著乳中PrP的發(fā)現(xiàn)再次向人們敲響了乳及乳制品安全性的警鐘[23-24]。

最近的幾年里,生物檢測新技術(shù)在PrP的安全性檢測中得到廣泛應(yīng)用,在取得重要突破的同時也成為生物安全領(lǐng)域一個新的研究熱點。近期研究發(fā)現(xiàn),PrP可以在患癢病綿羊的乳腺中自我復(fù)制,這就意味著羊乳有可能是TSE的傳染源,后來的試驗也證實了這一點。Konold等[25]對18只癢病易感基因型羔羊口服患病綿羊的乳,在死亡的羔羊回腸組織中發(fā)現(xiàn)了病變PrP,但沒有臨床表現(xiàn);7個月后試驗組15只羔羊檢測病變PrP全部呈陽性,對照組14只羔羊為陰性,但2組羔羊混合飼養(yǎng)后對照組中部分羔羊發(fā)病。這一研究不但證明癢病可以由乳傳播,而且可以在羊群中水平和垂直傳播。

類似的研究證明,食用患病或隱性感染山羊的初乳和常乳可以使小鼠感染羊的癢病,但感染小鼠的乳不具有二次傳染力[12]。由此研究者認(rèn)為不但動物體內(nèi)的細胞PrP可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏rP,而且體內(nèi)進入乳中的PrP也會發(fā)生這種空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[12],至此全面肯定了患TSE病動物的乳及乳制品不但是PrP的重要來源而且能傳播此病。在乳及乳制品的感染成分中,尤其以細胞碎片、酪蛋白乳清和乳酪的感染力較強,而初乳和常乳的感染滴度都比較低[18]。值得關(guān)注的是,種間傳播屏障的存在會降低乳的傳播風(fēng)險[18]。在傳播方式上,人工喂養(yǎng)比哺乳方式感染癢病的風(fēng)險要低[26]。

5 結(jié) 語

據(jù)統(tǒng)計,世界乳品年產(chǎn)量約5億t,占人類攝入蛋白質(zhì)的13%。這些乳品大多是均質(zhì)化處理并采取巴氏消毒或者超高溫滅菌,但這并不能破壞其中的朊蛋白。如果患有乳房炎等疾病的動物血-乳屏障遭到破壞,則乳中PrP含量增加,此時病變PrP積聚在乳腺管淋巴細胞中并能自我復(fù)制,從而殘留在乳中,大大增加了乳的安全隱患[22]。盡管如此,人類還是在不斷探索中通過檢疫等有效手段預(yù)防了類似“瘋牛病”的傳播。但同時,乳中PrP的安全性也不容忽視,對乳和乳制品及其安全性的研究使我們在乳品安全方面受到啟示:一方面,在加工過程中可以用現(xiàn)代生物技術(shù)檢測、調(diào)控或分離乳中的細胞甚至低豐度的特定蛋白質(zhì)[27-28];另一方面,在加強動物檢疫的同時可以選育牛羊等乳用動物的抗病能力[7,29],從源頭上為人類提供更安全的乳。

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Au thor,GUAN Feng,associate professor,E-mail:jlguanfeng@yahoo.com.cn

（編輯 菅景穎）