劉倚帆 徐 良 朱海燕 張立可 汪以真*

（1.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所,動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310029;2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,杭州 310029）

畜產(chǎn)品中的抗生素殘留問題越來越受到人們的重視,許多國家包括我國已經(jīng)嚴(yán)格限制或禁止將抗生素作為保健和促生長劑添加到畜禽飼料中。由于抗生素的亂用和濫用,許多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥菌株,并且其出現(xiàn)頻率已經(jīng)超過了抗生素新藥的開發(fā)速度,由此給疾病的治療帶來了很大困難。因此,研制安全、高效、環(huán)保型防病、保健、促生長添加劑就顯得尤為重要?？咕氖撬拗鞣翘禺愋悦庖叻烙到y(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體的肽類活性物質(zhì),是天然免疫的效應(yīng)分子[1]。研究表明,抗菌肽有著與傳統(tǒng)抗生素不同的作用機(jī)制,不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生;抗菌譜廣,對細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲及癌細(xì)胞均有作用;此外,還具有穩(wěn)定、水溶性好,對高等動(dòng)物正常細(xì)胞幾乎無害,在體內(nèi)無殘留等特點(diǎn)[2-3]。由于上述優(yōu)點(diǎn),抗菌肽成為學(xué)術(shù)界研究與開發(fā)的熱點(diǎn),然而,其抗菌活性還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)抗生素。目前,有2種策略提高抗菌肽的應(yīng)用價(jià)值:一是開發(fā)高效、低成本的抗菌肽及其衍生物;二是通過抗生素或其他化合物與抗菌肽的聯(lián)合應(yīng)用,來增強(qiáng)抗菌肽的活性?，F(xiàn)在,越來越多的研究涉及到抗菌肽與幾種常規(guī)抗生素的聯(lián)合使用,抗菌肽與抗生素的聯(lián)合使用可以提高抗生素的治療效果,在很大程度上降低抗生素的用量,并減小因使用抗生素帶來的藥物殘留及產(chǎn)生耐藥菌株等副作用[4]。有研究表明,抗菌肽能夠使具有疏水基的化合物最大限度地進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,更好地發(fā)揮抗菌作用,并且與親脂或兩性抗生素表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用[5]。

本試驗(yàn)研究了畜禽養(yǎng)殖業(yè)中常用的抗生素金霉素（aureom ycin）、新霉素（neom ycin）分別與牛乳鐵蛋白肽（Lactoferricin B,LFcin B）以及昆蟲類抗菌肽天蠶素A（Cecropin A）聯(lián)合使用對革蘭氏陰性菌和陽性菌的體外聯(lián)合抗菌效應(yīng),旨在通過兩兩聯(lián)合用藥的協(xié)同作用來擴(kuò)大抗菌譜,提高治療效果,同時(shí)達(dá)到降低用藥量,減少藥物殘留,避免或減少耐藥菌株產(chǎn)生的目的。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、豬霍亂沙門氏菌CMCC50013和銅綠假單胞菌CMCC10014均購自中國藥品生物制品檢定所,-80℃暗處保存,20%甘油凍存管中備用。

1.2 主要藥物和試劑

LFcin B和Cecropin A由吉爾生化（上海）有限公司合成。2種抗生素為金霉素和新霉素,購自浙江美迪康貿(mào)易公司,-80℃暗處保存。M ueller-Hinton（MH）肉湯培養(yǎng)基購自英國Difco公司。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素最小抑菌濃度（M IC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

采用Hancock實(shí)驗(yàn)室改良的微量肉湯稀釋法[6]測定LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素等4種抗菌藥物單用時(shí)的M IC。具體操作為:首先用無菌蒸餾水將抗菌肽配制成2 560μg/m L的儲(chǔ)備液,將抗生素配制成320μg/m L的儲(chǔ)備液,然后用無菌蒸餾水進(jìn)行一系列雙倍稀釋,分別得到質(zhì)量濃度為2 560、1 280、640…10、5μg/m L等10個(gè)系列濃度梯度的抗菌肽稀釋液,以及質(zhì)量濃度為320、160、80…1.25、0.625μg/m L等10個(gè)系列濃度梯度的抗生素稀釋液。

將待測細(xì)菌在滅菌MH肉湯瓊脂平板上過夜培養(yǎng),挑取菌落接種于滅菌試管中的MH肉湯,37℃250 r/min過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌液取30μL轉(zhuǎn)接至3m L新鮮MH肉湯液體培養(yǎng)基中,37℃250 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)2～5 h至對數(shù)生長期。將上述2次活化的菌液稀釋至2×105～7×105CFU/m L,向無菌96孔板（Corning,美國）中的第1～10孔依次加入90μL制備好的菌液,第11孔加入100μL菌懸液作為陽性對照,第12孔加入100μL MH肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照。然后從第1～10孔逐一加入10μL相應(yīng)濃度的抗菌肽稀釋液或抗生素稀釋液,使得待測肽的終濃度分別為256、128、64…1、0.5μg/m L,待測抗生素的終濃度分別為32、16、8…0.125、0.062 5μg/m L。將培養(yǎng)板震蕩均勻后放在濕盒中,于37℃下靜置培養(yǎng)18～24 h,以孔中彌散渾濁、底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀為細(xì)菌生長指標(biāo),無肉眼可見細(xì)菌沉淀的最小濃度判定為抗菌肽或抗生素的最小抑菌濃度。每種抗菌物質(zhì)做3次重復(fù)。

從沒有細(xì)菌生長的最高濃度的3個(gè)平板孔中各取10μL內(nèi)容物滴加到MH瓊脂平板上,每孔做3個(gè)重復(fù),待完全吸收后,37℃下培養(yǎng)18～24 h,根據(jù)是否有菌落生長來確定抗菌物質(zhì)的最小殺菌濃度。

1.3.2 LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

采用肉湯稀釋棋盤試驗(yàn),對參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn),采取6×6棋盤,根據(jù)所測得的每種藥物對每種菌株的M IC值,將每種藥物的最高濃度設(shè)定為2×M IC,然后用無菌蒸餾水進(jìn)行一系列雙倍稀釋,細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.3.1。以LFcin B和Cecropin A聯(lián)合使用為例,LFcin B以橫行方式, Cecropin A以縱列方式,將5μL各自不同濃度的藥液加入96孔板中,每孔再加菌液90μL,使96孔板的每1橫行孔中Cecropin A濃度不變,LFcin B濃度則依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16倍M IC;96孔板的每1縱列孔中LFcin B濃度不變,Cecropin A濃度則依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16倍MIC。將培養(yǎng)板震蕩均勻后放在濕盒中,于37℃下靜置培養(yǎng)18～24 h。在實(shí)驗(yàn)室中以部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index,FIC index）作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)。FIC index= [M IC（A）/MICA]+[MIC（B）/M ICB],其中,M ICA和M ICB分別代表A藥物和B藥物單獨(dú)使用時(shí)的MIC值,M IC（A）和MIC（B）分別代表A藥物和B藥物聯(lián)合用藥時(shí)各自的M IC值。依據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷聯(lián)合用藥的效果。FIC index≤0.5,為協(xié)同作用;0.5＜FIC index≤1,為部分協(xié)同或相加作用;1＜FIC index≤2,為無關(guān)作用;FIC index＞2,為拮抗作用。各組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素單獨(dú)使用時(shí)的M IC和MBC

抗菌肽和抗生素對所試4種菌株的M IC值及MBC值分別見表1和表2。結(jié)果表明,2種抗菌肽LFcin B、Cecropin A和2種抗生素金霉素、新霉素對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌均有抑制作用,但抑制效果不同?？傮w來說,革蘭氏陰性菌對Cecropin A比對LFcin B更敏感。但革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌對Cecropin A不敏感,在設(shè)定濃度范圍內(nèi)檢測不到其M IC值。金黃色葡萄球菌也是受試菌株中對抗生素表現(xiàn)最敏感的,其中金霉素對金黃色葡萄球菌的M IC達(dá)到0.062 5μg/m L?？股貙λ?種菌株的抑制作用均明顯強(qiáng)于抗菌肽。

表1 LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素對4種受試菌的最小抑菌濃度Tab le 1 M ICs of LFcin B,Cecropin A,aureomycin and neom ycin against 4 strains o f tested bacteriaμg/m L

表2 LFcin B、CecropinA、金霉素和新霉素對4種受試菌的最小殺菌濃度Table 2 MBCs o f LFcin B,Cecropin A,aureom ycin and neomycin against 4 strains o f tested bacteriaμg/m L

2.2 LFcin B、Cecropin A、金霉素和新霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

由表3可知,Cecropin A與LFcin B聯(lián)合使用對所試革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)為協(xié)同作用,LFcin B聯(lián)用時(shí)的M IC是單用時(shí)的1/4,Cecropin A聯(lián)用時(shí)的MIC是單用時(shí)的1/8～1/4;雖然無法計(jì)算兩者聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌的FIC指數(shù),但可以看出LFcin B聯(lián)用時(shí)的M IC是單用時(shí)的1/2,其抗菌活性增強(qiáng)。由表4和表5可知,金霉素與LFcin B或Cecropin A聯(lián)合使用,對所試革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌表現(xiàn)為協(xié)同作用,金霉素和LFcin B或Cecropin A聯(lián)用時(shí)的M IC都分別是單用時(shí)的1/8～1/4和1/8～1/2;由表6和表7可知,新霉素與LFcin B或Cecropin A聯(lián)合使用時(shí),對所試4種菌株均表現(xiàn)為無關(guān)作用。同樣,雖然無法計(jì)算金霉素、新霉素分別與Cecropin A聯(lián)合使用時(shí)對金黃色葡萄球菌的FIC指數(shù),但可以看出聯(lián)合使用后金霉素、新霉素的M IC值都是單用時(shí)的1/2。由表3至表7還可以看出,4種藥物的兩兩合用對4種受試菌株均不表現(xiàn)拮抗作用。

表3 LFcin B、Cecropin A單用和聯(lián)用的作用效果Tab le 3 Ef fects of LFcin B and Cecropin A alone and in combination against 4 strains o f tested bacteria

表4 LFcin B、金霉素單用或聯(lián)用的作用效果Tab le 4 Ef fects of LFcin B and aureomycin alone and in com bination against 4 strains o f tested bac teria

表5 Cecropin A、金霉素單用和聯(lián)用的作用效果Tab le 5 Effects o f Cecropin A and aureomycin alone and in combination against 4 strains o f tested bacteria

表6 LFcin B、新霉素單用和聯(lián)用的作用效果Tab le 6 Effects o f LFcin B and neom ycin alone and in combination against 4 strains o f tested bacteria

3 討 論

細(xì)菌感染引起的仔豬腹瀉等問題已經(jīng)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn),尤其是耐藥菌株的出現(xiàn),更是增加了疾病治療的難度。目前,細(xì)菌的耐藥性突變是一個(gè)普遍存在的問題,在一些革蘭氏陰性菌和陽性菌中存在多藥耐受性?？股匾话闶峭ㄟ^抑制細(xì)菌細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)或DNA等的合成來達(dá)到殺菌目的,細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一是由于突變產(chǎn)生了分解抗生素的酶基因,這種突變往往改變一個(gè)或幾個(gè)基因就可以實(shí)現(xiàn)[8],而抗菌肽主要是通過與細(xì)胞膜作用而殺菌,細(xì)菌產(chǎn)生膜結(jié)構(gòu)的突變比較困難,不易產(chǎn)生耐藥性,因此,有望將抗菌肽開發(fā)成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。但天然的抗菌肽并非完美無缺,其抗菌活性還遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上抗生素,還有一部分抗菌肽對真核細(xì)胞具有一定的毒性,因此,如何提高抗菌肽的抗菌活性并最大限度降低毒性,使其能快速、有效地殺滅病原菌,成為人們關(guān)注與研究的熱點(diǎn)。

表7 Cecropin A、新霉素單用和聯(lián)用的作用效果Table 7 Ef fects of Cecropin A and neomycin alone and in combination against 4 strains of tested bacteria

許多研究表明,抗菌物質(zhì)之間的協(xié)同作用,不僅可以提高抗菌治療的作用,而且可以解釋一些新型抗生素的抗菌機(jī)制。關(guān)于抗菌肽協(xié)同作用的研究已經(jīng)有很多報(bào)道,Westerhoff等[9]發(fā)現(xiàn)來源于非洲爪蟾的抗菌肽magainina-2和PGLa具有顯著的協(xié)同作用。Vorland等[10]報(bào)道紅霉素和LFcin B聯(lián)合使用對大腸桿菌具有協(xié)同抗菌作用,但LFcin B和盤尼西林G、萬古霉素、慶大霉素等聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌卻沒有協(xié)同抗菌作用。Wakabayashi等[7]研究表明,二甲胺四環(huán)素和單酰甘油能增強(qiáng)LFcin B抗金黃色葡萄球菌的抗菌活性,但甲氧苯青霉素、頭孢去甲噻肟等不能增強(qiáng)其對金黃色葡萄球菌的抗菌活性?，F(xiàn)在已知的4種協(xié)同抗菌機(jī)制包括:抑制一系列生化途徑致細(xì)菌死亡,抑制保護(hù)性細(xì)菌酶的活性,增強(qiáng)對細(xì)菌細(xì)胞壁的聯(lián)合作用以及增強(qiáng)其他抗菌物質(zhì)的攝取等[11]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,Cecropin A與LFcin B聯(lián)合使用對革蘭氏陰性菌具有顯著協(xié)同作用,聯(lián)用時(shí)LFcin B的M IC是單用時(shí)的1/4,Cecropin A的MIC是單用時(shí)的1/8～1/4,其原因可能是二者的作用機(jī)制不一樣。Cecropin A屬于膜穿孔型抗菌肽,其抗菌機(jī)理是在微生物細(xì)胞膜上形成通道,引起細(xì)胞質(zhì)溢流。Lockey等[12]利用電子顯微鏡和免疫膠體金技術(shù)觀察到Cecropin A結(jié)合到大腸桿菌膜上,形成9.6 nm直徑的病灶,其孔道直徑為4.2 nm,孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄,細(xì)菌死亡。研究表明,LF-cin B可以與細(xì)胞膜結(jié)合,在膜上形成瞬時(shí)孔洞,使更多的LFcin B進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),與胞內(nèi)大分子物質(zhì)結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)、DNA和/或RNA的合成[13-15]。也許正是由于Cecropin A引起的膜上通道的形成,為LFcin B進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)創(chuàng)造了條件,從而導(dǎo)致聯(lián)用后的抗菌活性明顯增強(qiáng)。

金霉素與LFcin B聯(lián)合使用對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有顯著協(xié)同作用,兩者聯(lián)用時(shí)的M IC值是單用時(shí)的1/8～1/4,抗菌活性增強(qiáng)。金霉素屬于四環(huán)素類抗生素,其抗菌機(jī)制是該藥物與細(xì)菌核蛋白體30S亞基在A位特異性結(jié)合,阻止肽鏈延伸并抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[16]。LFcin B與結(jié)合在細(xì)胞外膜脂多糖表面的2價(jià)陽離子（M g2+、Ca2+）競爭性結(jié)合細(xì)胞表面的陰離子成分,而金霉素可以吸附一部分陽離子,有利于LFcin B與細(xì)胞膜的結(jié)合。因此,兩者具有相互促進(jìn)作用。另外,LFcin B與細(xì)胞膜結(jié)合后,使細(xì)胞表面形成孔洞加速胞質(zhì)外漏,促使更多的抗菌肽和金霉素進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮作用。同時(shí),有研究認(rèn)為,這種協(xié)同作用是因?yàn)長Fcin B干擾膜的正常生理功能,從而導(dǎo)致了細(xì)菌細(xì)胞壁滲透作用增強(qiáng),同時(shí)使膜電勢紊亂,最終造成細(xì)菌ATP依賴性傳遞耐藥排出系統(tǒng)活性降低[7]。

新霉素單用時(shí)對所試4種菌株均有很好的殺菌效果,但與LFcin B或Cecropin A聯(lián)合使用時(shí),沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。新霉素屬于氨基糖苷類抗生素,主要抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,其殺菌作用呈濃度依賴性。有研究報(bào)道氨基糖苷類抗生素可以競爭性地取代細(xì)胞膜上的Mg2+、Ca2+,從而導(dǎo)致正常細(xì)胞膜屏障破壞,在細(xì)胞膜上形成瞬間孔道,破壞膜的滲透性[10]。新霉素的這種對細(xì)胞膜的作用機(jī)制,可能競爭性地阻止了Cecropin A、LFcin B與細(xì)胞膜上靶位點(diǎn)的結(jié)合,從而導(dǎo)致其不能有效地發(fā)揮抗菌作用。

4 結(jié) 論

LFcin B與Cecropin A、LFcin B與金霉素、Cecropin A與金霉素對革蘭氏陰性菌及陽性菌均具有協(xié)同抑制作用,并且有效地降低了金霉素的抑菌濃度。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:yzw ang@zju.edu.cn

（編輯 尚彬如）