胡 鵬 占秀安* 郄彥昭 王永俠 趙茹茜

（1.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所,杭州 310029;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095）

硒是動(dòng)物必需的微量元素之一,硒能參與機(jī)體谷胱甘肽過氧化物酶的合成,保持動(dòng)物機(jī)體健康,保護(hù)胰臟,從而維持胰臟正常功能,促進(jìn)消化酶分泌,促進(jìn)畜禽生長。硒有無機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式,與無機(jī)硒相比,有機(jī)硒在動(dòng)物體內(nèi)具有吸收率高、生物活性強(qiáng)、毒性低、環(huán)境污染小等特點(diǎn)[1-2]。因此,近年來有機(jī)硒替代無機(jī)硒成為研究熱點(diǎn)。Mahan等[3]報(bào)道,酵母硒可增加組織硒濃度,有助于維持組織細(xì)胞的完整性,減少豬肉的滴水損失。Danny[4]認(rèn)為以酵母硒的形式向母豬飼糧中添加的有機(jī)硒,有機(jī)硒的生物利用率高于以亞硒酸鈉形式提供的無機(jī)硒。而酵母硒的主要成分是DL-硒代蛋氨酸?，F(xiàn)階段國內(nèi)對(duì)有機(jī)硒的研究也很多,但關(guān)于母豬飼喂DL-硒代蛋氨酸后對(duì)后代乳豬胰臟功能的影響則未見報(bào)道。為了解DL-硒代蛋氨酸對(duì)“長×大”母豬后代胰臟功能的影響,本試驗(yàn)以高純度DL-硒代蛋氨酸作為有機(jī)硒源,亞硒酸鈉為對(duì)照,研究了母種豬飼糧中添加不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟組織硒沉積、抗氧化能力、消化酶分泌以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）基因表達(dá)的影響,旨在探討DL-硒代蛋氨酸對(duì)母種豬傳代效應(yīng)的應(yīng)用效果,并為其推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DL-硒代蛋氨酸（純度99.5%）,亞硒酸鈉（純度98.0%）,由Sigm a公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)選用浙江嘉興欣欣養(yǎng)殖場(chǎng)提供的“長×大”母豬,試驗(yàn)飼糧為參照NRC（1998）妊娠期和泌乳期母豬營養(yǎng)需要配合而成的顆粒狀飼料,其飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab le 1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-d ry basis）%

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇妊娠后期、胎次相同的“長×大”母豬12頭,隨機(jī)分為2組,分別設(shè)為亞硒酸鈉組（sodium selenite group）和DL-硒代蛋氨酸組（DL-selenom ethionine group）,在基礎(chǔ)飼糧中（硒的實(shí)測(cè)值為0.04 mg/kg）添加亞硒酸鈉和DL-硒代蛋氨酸各0.3 mg/kg,每組6個(gè)重復(fù),每重復(fù)1頭。試驗(yàn)分妊娠后期（32 d）和泌乳期（28 d）2個(gè)階段,共60 d,分別飼喂妊娠期和泌乳期飼糧。試驗(yàn)?zāi)肛i每天于06:00、12:00和17:00飼喂3次,妊娠后期每次每頭喂料1.3 kg,泌乳期每次每頭喂料2.0 kg。自由飲水,保持產(chǎn)房清潔、通風(fēng)。乳豬喂乳不喂料直至斷奶。

1.4 樣品采集與保存

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)重復(fù)選取體重相近（約7 kg）的乳豬（母）1頭,共12頭,進(jìn)行屠宰。宰前禁飼24 h,自由飲水。常規(guī)屠宰,分離胰臟并稱重,置于-70℃冰箱中保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.5.1 乳豬胰臟指數(shù)

胰臟指數(shù)（%）=（胰臟重/宰前活豬重）×100。

1.5.2 乳豬胰臟硒含量測(cè)定

稱取0.2 g左右樣品于微波消解罐中,加入1m L過氧化氫,擰緊罐蓋,于微波消解系統(tǒng)內(nèi)消解7m in左右,消解至無色透明液,冷卻后取出用超純水定容至10m L,取過濾消化液2 m L于10m L試管中,加體積分?jǐn)?shù)為50%的鹽酸溶液1 m L,加入5%硫脲和5%抗壞血酸的混合液1 m L,反應(yīng)15 m in后用超純水定容,混勻,于AFS-230a雙道原子熒光光度計(jì)上機(jī)測(cè)定,同樣方法做空白對(duì)照。

1.5.3 乳豬胰臟抗氧化指標(biāo)測(cè)定

GSH-Px、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）采用試劑盒測(cè)定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 乳豬胰臟消化酶測(cè)定

樣品處理:稱取0.2 g左右胰臟,加4.0m L生理鹽水,勻漿,4℃放置24 h,5 000 r/min離心15 m in。取一部分上清液直接用于測(cè)定胰蛋白酶（LPS）、淀粉酶（AMS）和脂肪酶（TPS）活性。胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性采用試劑盒方法測(cè)定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 胰臟中GSH-Px mRNA表達(dá)量的測(cè)定

取乳豬胰臟組織后,立即按照Trizo l試劑（Invtrogen公司）的說明書提取總RNA,測(cè)定RNA的純度及含量,然后對(duì)GSH-Px進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取總RNA 2μg,按BBI公司MM LV Reverse Transcrip tase cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA, -20℃保存。根據(jù)試劑說明書配制RT-PCR反應(yīng)液,將反應(yīng)液置于熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）上進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。GSH-Px基因（登錄號(hào):NM_214201）和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因（登錄號(hào):AF017079）采用Primer exp ress 2.0和Beacon designer熒光引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物,引物由上海生物工程有限公司合成,序列見表2。RT-PCR使用的預(yù)變性條件為:95℃預(yù)變性,10 s;45個(gè)循環(huán)分別經(jīng)歷了3個(gè)過程（95℃變性,5 s;60℃退火/延伸,25 s）。用比較模板的域值循環(huán)數(shù)（Ct）相對(duì)定量法研究乳豬胰臟組織中GSH-Px基因表達(dá)。以內(nèi)參基因GAPDH為參比,則Ct的相對(duì)量為△Ct=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH）。 GSH-Px基因相對(duì)表達(dá)水平以2-△△Ct表示。

表2 GSH-Px和GAPDH基因引物序列Table 2 Primer sequence of genes for GSH-Px and GAPDH

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 胰臟指數(shù)、硒含量和抗氧化指標(biāo)

由圖1可見,母種豬飼喂DL-硒代蛋氨酸后,后代乳豬胰臟指數(shù)有提高趨勢(shì)（P＞0.05）,胰臟組織硒含量也提高了54.29%（P＜0.01）。

圖1 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟指數(shù)和胰臟硒含量的影響Fig.1 Effects of adding dif ferent Se sources to the sow diet on pancreas index and Se content in pancreas o f suck ling pigs（n=6）

由表3可見,與亞硒酸鈉組比,母種豬飼糧中添加DL-硒代蛋氨酸使后代乳豬胰臟T-AOC提高了112.52%（P＜0.01）;GSH-Px活性提高了22.84%（P＜0.01）;SOD活性提高了24.60%（P＜0.01）;GSH含量提高了131.14%（P＜0.01）; MDA含量降低了25.55%（P＜0.01）。

2.2 乳豬胰臟組織消化酶活性

表4表明,與亞硒酸鈉組相比,母豬飼糧添加DL-硒代蛋氨酸使后代乳豬胰臟中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性分別提高了50.81%（P＜0.01）、17.61%（P＜0.05）和14.87%（P＜0.05）。

2.3 乳豬胰臟組織GSH-Px mRNA的表達(dá)

GAPDH引物和GSH-Px引物的溶解曲線引物擴(kuò)增均具有單一的熔點(diǎn)曲線峰圖,說明二者均具有較強(qiáng)的特異性。GAPDH m RNA及GSH-Px m RNA擴(kuò)增S形曲線很好,檢測(cè)到的熒光信號(hào)也高,說明該方法可以對(duì)本試驗(yàn)中的陽性模板進(jìn)行高效擴(kuò)增,從而進(jìn)行準(zhǔn)確定量。以不同梯度定量模板數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,胰臟組織中GAPDH m RNA和GSH-Px m RNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線表明不同梯度定量模板數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值之間存在較好的相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均在0.996以上。隨后計(jì)算目的基因GSH-Px相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的△△Ct值,并計(jì)算GSH-Px基因相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如圖2,以GAPDH為內(nèi)參,2-△△Ct值為1.31＞1,表明DL-硒代蛋氨酸處理后,GSH-Px m RNA的表達(dá)有所上調(diào)且差異顯著（P＜0.01）。

表3 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟抗氧化指標(biāo)的影響Tab le 3 Effects o f adding different Se sources to the sow diet on antioxidant indices in pancreas of suck ling pigs（n=6）

表4 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟消化酶活性的影響Table 4 Effects o f adding different selenium sources to the sow diet on pancreas digestive enzyme activities of sucking pigs（n=6）

圖2 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟組織GSH-PxmRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of adding different Se sources to the sow diet on pancreas GSH-Pxm RNA level in sucking pigs（n=6）

3 討 論

3.1 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟指數(shù)、硒含量和抗氧化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),妊娠后期母種豬補(bǔ)充DL-硒代蛋氨酸至28 d斷奶較亞硒酸鈉,顯著提高了后代乳豬胰臟組織硒含量,這與M ahan等[5-6]和Kim等[7]的研究結(jié)果基本一致,且胰臟指數(shù)也有提高趨勢(shì)。血液中GSH-Px及SOD活性、MDA含量、TAOC是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[8]。本研究表明,母種豬飼糧中添加DL-硒代蛋氨酸相對(duì)于亞硒酸鈉顯著提高了后代乳豬胰臟中T-AOC、GSH-Px活性、SOD活性和GSH水平,降低了MDA含量,這說明DL-硒代蛋氨酸相對(duì)于亞硒酸納可以明顯提高后代乳豬的抗氧化能力,推測(cè)這可能由有機(jī)硒和無機(jī)硒的代謝途徑不同所導(dǎo)致的結(jié)果,無機(jī)硒在動(dòng)物腸道中是被動(dòng)吸收的,有機(jī)硒則是以氨基酸的運(yùn)輸機(jī)制主動(dòng)吸收,有機(jī)硒使總硒的貯存量增加,為硒在組織中的貯存提供了一個(gè)硒庫。無機(jī)硒的代謝通路中,僅有很少量的無機(jī)硒結(jié)合進(jìn)入體蛋白,大多數(shù)未能用于合成硒蛋白的硒進(jìn)入腎臟,最終排出體外[9-10]。

3.2 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟組織消化酶活性的影響

胰臟具有內(nèi)分泌和外分泌的功能,內(nèi)分泌主要分泌胰島素、胰高血糖素和補(bǔ)體素,外分泌主要分泌胰淀粉酶、胃蛋白酶及胰凝蛋白酶、脂肪酶和胰臟核酸酶。消化酶活性是反映機(jī)體消化生理機(jī)能的一項(xiàng)重要指標(biāo),直接影響蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。張桂珍等[11]研究表明,在克山病區(qū)飼糧中補(bǔ)充一定劑量硒可明顯提高大鼠血清淀粉酶與脂肪酶活性,增加胰腺腺泡淀粉酶與脂肪酶的合成。郭孝等[12]給W istar大白鼠飼糧添加高硒鈷苜蓿青草粉后,能夠顯著增強(qiáng)大白鼠的胃蛋白酶活性,減少飼糧在胃內(nèi)的殘留率,提高飼糧在小腸內(nèi)的推進(jìn)率。這說明硒能提高哺乳動(dòng)物消化酶活性,改善飼料轉(zhuǎn)化效率和生長性能。本試驗(yàn)飼糧添加DL-硒代蛋氨酸后使后代乳豬相對(duì)對(duì)照組淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著提高,進(jìn)而推測(cè)有機(jī)硒相對(duì)無機(jī)硒更能促進(jìn)后代乳豬胰臟內(nèi)分泌的調(diào)節(jié),促進(jìn)胰臟消化酶的分泌,從而促進(jìn)生長。

3.3 母種豬補(bǔ)充不同硒源對(duì)后代乳豬胰臟組織GSH-PxmRNA表達(dá)的影響

前已述及,母種豬補(bǔ)充DL-硒代蛋氨酸較亞硒酸鈉顯著提高了后代乳豬胰臟中的GSH-Px活性。由于硒是GSH-Px中的重要成分,它催化過氧化物還原[13],因此硒與GSH-Px含量呈正相關(guān)。而本試驗(yàn)已證實(shí),飼喂DL-硒代蛋氨酸較亞硒酸鈉顯著地提高了后代乳豬胰臟中的硒含量,從而推測(cè)DL-硒代蛋氨酸組胰臟組織GSH-Px活性可能會(huì)高于亞硒酸鈉組,但尚未從基因表達(dá)水平對(duì)其進(jìn)行確證,又因?yàn)槲c胰臟的關(guān)系密切,且氧化應(yīng)激是缺硒損害動(dòng)物組織的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此,檢測(cè)胰臟中的GSH-Px mRNA具有重要意義。Qin等[14]報(bào)道,小鼠飼糧中添加0.1 mg/kg硒水平的亞硒酸鈉和酵母硒,酵母硒組小鼠血清GSH-Px活性顯著高于亞硒酸鈉組,小鼠肝臟GSH-Pxm RNA豐度值也表現(xiàn)出一致的規(guī)律性。本試驗(yàn)首次研究表明,母種豬飼糧添加DL-硒代蛋氨酸同比亞硒酸鈉顯著提高了后代乳豬胰臟組織GSH-Px m RNA表達(dá)。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下,母種豬飼糧中補(bǔ)充同一水平（0.3 m g/kg）的DL-硒代蛋氨酸較亞硒酸鈉可顯著提高后代乳豬胰臟組織硒含量（P＜0.01）、抗氧化能力（P＜0.01）、消化酶活性（P＜0.05,P＜0.01）、GSH-Px m RNA表達(dá)量（P＜0.01）。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:xazan@zju.edu.cn

（編輯 武海龍）