蔣瑞瑞 趙桂蘋 陳繼蘭 鄭麥青 劉冉冉 李 鵬 胡耀東 文杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193）

與哺乳動(dòng)物相比較而言,禽肉的脂肪沉積主要為皮下脂肪和腹脂,肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積僅占體脂沉積的很小一部分。腹脂通常作為下腳料被廢棄,而IMF的沉積量與肉的風(fēng)味和多汁性顯著相關(guān)[1]。由于沉積單位脂肪比沉積單位瘦肉要多耗3倍的能量,肉雞腹脂和皮脂的過(guò)多沉積,一方面造成能量浪費(fèi),另一方面也不符合人們?nèi)找嫣岣叩膶?duì)肉品質(zhì)的要求。愛(ài)拔益加（AA）肉雞生長(zhǎng)速度快,生產(chǎn)效率高,但是肉質(zhì)風(fēng)味欠佳,北京油雞生長(zhǎng)速度慢,相對(duì)效率低,但肉質(zhì)細(xì)膩、鮮美。機(jī)體脂肪代謝和調(diào)控機(jī)制的差異是造成不同品種脂肪分布與沉積量差異的內(nèi)在機(jī)制之一,但是目前仍不十分明了。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,近年來(lái)開(kāi)展了許多功能基因和候選基因的研究工作,脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、甘油三酯脂酶（ATGL）、載脂蛋白A（apoA）、載脂蛋白B （apoB）等基因是被證實(shí)了的與脂肪代謝相關(guān)的基因[2-7],為進(jìn)一步的研究提供了理論基礎(chǔ)。本研究選擇了生長(zhǎng)速度和脂肪沉積存在顯著差異的2個(gè)品種（AA肉雞和北京油雞）為研究素材,通過(guò)比較在相同日齡和不同上市日齡的體脂沉積量、血脂代謝水平、酶活以及相關(guān)基因m RNA表達(dá)量,以期在不同調(diào)控層面上探討造成品種間脂肪沉積差異的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制,為肉雞的選育工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選用體重均一的1日齡雌性AA肉雞60只和北京油雞120只,每個(gè)品種隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)（AA肉雞每重復(fù)10只,北京油雞每重復(fù)20只）,飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)雞舍。育雛前2天室溫保持35℃,從第3天開(kāi)始至第28天逐漸降溫至28℃,之后維持室溫28℃,相對(duì)濕度為45%,24 h光照。自由采食和飲水。以《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)）》（2004）建議量配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of diets（air-d ry basis）%

1.2 樣品的采集和測(cè)定

1.2.1 樣品采集和屠體指標(biāo)的測(cè)量

由于生長(zhǎng)速度的差異,AA肉雞飼養(yǎng)至56日齡進(jìn)行屠宰,北京油雞分別于56日齡和114日齡（上市日齡）進(jìn)行屠宰。禁食12 h后,每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取6只雞稱量活體重并采集全血（3只/重復(fù),翅靜脈采血,分離血漿備用）,頸靜脈放血處死,脫毛后盡快取肝臟、胸肌和腹脂各50～100mg,速凍于液氮中,用于提取m RNA。用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮脂厚和肌間脂帶寬（3只/重復(fù)）。剝離腹脂、雙側(cè)胸肌和腿肌并稱重,計(jì)算胸肌率、腿肌率和腹脂率（相對(duì)于活體重的比例）。采用索氏抽提法測(cè)定胸肌IMF含量[8]。

1.2.2 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定血漿總甘油三酯（TG,F001）、總膽固醇（TCHO, F002）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC,F003）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC,F004）、游離脂肪酸（FFA, A 042）濃度及血漿脂蛋白酯酶（LPL,A 067）活性和肝臟蘋果酸脫氫酶（MDH,A 021）活性。用雞脂聯(lián)素（adiponectin）和瘦素（leptin）ELISA試劑盒（Ad litteram Diagnostic Laboratories Inc.,USA）測(cè)定血漿中的脂聯(lián)素和瘦素濃度。

1.2.3 基因表達(dá)豐度的熒光定量分析

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和完整性。用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,所有的cDNA用18S rRNA檢測(cè)。本研究定量的基因及其引物序列見(jiàn)表2。采用SYBR Green熒光染料法,在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量分析。20μL反應(yīng)體系中包括:10μL 2× SYBR GreenⅠRT-PCR Master M ix（App lied Biosystems,Foster City,USA）,上下游引物各0.75μL（10 pmol/μL）,1μL cDNA模板和7.5μL無(wú)RNA酶的去離子水。循環(huán)程序?yàn)?50℃2 m in （消除非特異擴(kuò)增及遺留污染）,95℃10 m in（活化Am pliTaq Gold酶）,95℃變性15s,61～65℃退火（具體基因見(jiàn)表2）、延伸共60 s（40個(gè)循環(huán)）,每次延伸結(jié)束后采集1次熒光信號(hào)。通過(guò)計(jì)算2-ΔΔCT值來(lái)衡量不同品種間基因相對(duì)表達(dá)量的差異[9]。ΔΔCT= （CT目的基因-CT18S rRNA）-（CT考察組-CT對(duì)照組）。本試驗(yàn)以56日齡北京油雞的基因m RNA表達(dá)量為對(duì)照組,指定其表達(dá)水平為1。

表2 基因序列號(hào)及引物序列Table 2 Gene accession numbers and p rimer sequences

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件一般線性模型（GLM）中的ANOVA程序,對(duì)56日齡AA肉雞、56日齡和114日齡北京油雞的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析,差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 胴體品質(zhì)和脂肪沉積

由表3可知,除腹脂率和IM F含量之外,56日齡AA肉雞的各項(xiàng)胴體指標(biāo)均顯著高于同日齡和上市日齡的北京油雞（P＜0.05）。56日齡AA肉雞腹脂率高于同日齡的北京油雞（P＜0.05）,但是低于上市日齡的北京油雞（P＜0.05）。北京油雞的半凈膛率并沒(méi)有隨日齡的增長(zhǎng)發(fā)生顯著變化（P＞0.05）,其他指標(biāo)均顯著增加（P＜0.05）。相同日齡時(shí)北京油雞IM F含量低于AA肉雞（P＜0.05）,但上市日齡時(shí)2個(gè)品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 愛(ài)拔益加肉雞和北京油雞胴體品質(zhì)和脂肪沉積Table 3 Carcass characteristics and fat deposition of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.2 血液生化指標(biāo)及酶活

由表4可知,56日齡和114日齡的北京油雞血漿TG、FFA和脂聯(lián)素濃度,血漿LPL活性和肝臟MDH活性均高于56日齡AA肉雞（P＜0.05）。2個(gè)品種間HDLC濃度僅在56日齡時(shí)有顯著差異,北京油雞高于AA肉雞（P＜0.05）。品種和日齡對(duì)血漿TCHO和瘦素濃度均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。品種對(duì)血漿LDLC濃度的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）,但114日齡北京油雞血漿LDLC濃度低于56日齡（P＜0.05）。隨日齡增大,北京油雞血漿脂聯(lián)素濃度和肝臟MDH活性增加（P＜0.05）,血漿HDLC濃度和LPL活性減小（P＜0.05）。

表4 愛(ài)拔益加肉雞和北京油雞血液生化指標(biāo)及酶活Table 4 Blood biochem ical indices and enzyme activities of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.3 脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)

由表5可知,56日齡AA肉雞肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA表達(dá)量高于56日齡和114日齡北京油雞（P＜0.05）,脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量高于114日齡北京油雞（P＜0.05）,56日齡北京油雞肝臟apoB基因m RNA表達(dá)量高于114日齡（P＜0.05）,但品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 愛(ài)拔益加肉雞和北京油雞肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)Table 5 Related genes expression in hepatic fat of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

由表6可知,56日齡AA肉雞腹脂中的ATGL和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因m RNA表達(dá)量高于114日齡的北京油雞（P＜0.05）,脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）基因和脂聯(lián)素基因mRNA表達(dá)量低于114日齡北京油雞（P＜0.05）;56日齡AA肉雞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）基因mRNA表達(dá)量低于56日齡北京油雞（P＜0.05）;隨著日齡的增加,北京油雞腹脂A-FABP基因m RNA表達(dá)量增加（P＜0.05）,PPARγ基因m RNA表達(dá)量降低（P＜0.05）。品種和日齡對(duì)腹脂過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）基因mRNA的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

表6 愛(ài)拔益加肉雞和北京油雞腹脂脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)Tab le 6 Re lated genes exp ression in abdom inal fat of AA broilers and Beijing-you（BJY）chickens

2.4 基因表達(dá)與體重和腹脂率的相關(guān)分析

由表7的相關(guān)分析結(jié)果表明,肝臟apoA-Ⅰ、腹脂ATGL和H-FABP基因m RNA表達(dá)量與體重顯著正相關(guān)（P＜0.05）,腹脂A-FABP基因m RNA表達(dá)量與腹脂率顯著正相關(guān)（P＜0.05）。腹脂H-FABP基因m RNA表達(dá)量與腹脂ATGL基因和肝臟脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）。腹脂PPARα基因m RNA表達(dá)量與腹脂ATGL、H-FABP以及肝臟apoB和脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān)（P＜0.05）。肝臟中脂聯(lián)素基因mRNA表達(dá)量與apoA-Ⅰ基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān)（P＜0.05）,而腹脂中脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量與A TGL基因m RNA表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表7 基因表達(dá)相關(guān)分析Tab le 7 Correlation analysis of gene exp ression

3 討 論

考慮到育肥期對(duì)脂肪沉積的影響和2個(gè)品種上市日齡的巨大差異,本研究將56日齡AA肉雞分別與56日齡（相同日齡）和114日齡（上市日齡）北京油雞各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,相同日齡時(shí)AA肉雞的體增長(zhǎng)和脂肪沉積速度均遠(yuǎn)大于北京油雞;但是生長(zhǎng)后期北京油雞脂肪沉積的潛力更大,腹脂率和IMF含量分別比AA肉雞高66.87%和 6.29%,其中,IMF含量的差異并沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

家禽肝外脂肪的沉積依賴于脂蛋白代謝的2個(gè)連續(xù)步驟:1）脂蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)速率;2）脂蛋白在血管內(nèi)的降解及脂肪被脂肪組織吸收和貯存速度[10]。MDH是脂肪合成的關(guān)鍵酶之一,主要存在于肝臟,該酶活性與肉仔雞腹脂和體脂含量有關(guān)[11]。雞肝臟形成的脂肪以極低密度脂蛋白（V LDL）形式釋放出來(lái),在LPL的作用下在外周組織被水解,產(chǎn)生的脂肪酸被外周組織吸收用于氧化或酯化并以甘油三酯的形式被貯存。56日齡和114日齡北京油雞肝臟MDH和血漿LPL活性均高于AA肉雞,提示北京油雞具有更強(qiáng)的脂肪合成能力和水解VLDL的能力,從而使更多的FFA進(jìn)入外周組織。本試驗(yàn)中2個(gè)日齡北京油雞血漿TG和FFA濃度均顯著高于AA肉雞,推測(cè)與北京油雞具有較高的肝臟MDH和血漿LPL活性有關(guān)。

apoA-Ⅰ是高密度脂蛋白（HDL）的重要組成部分,對(duì)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡起重要作用[12]。肝臟和小腸是育成雞apoA-Ⅰ合成和分泌的主要部位[13],血漿HDL濃度與肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA水平相關(guān)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于北京油雞而言,肝臟apoA-Ⅰ基因mRNA表達(dá)量和HDLC濃度隨日齡的增加變化趨勢(shì)一致。AA肉雞肝臟apoA-Ⅰ基因m RNA表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于北京油雞,該結(jié)果與李文娟[16]報(bào)道一致。本研究相關(guān)分析結(jié)果表明,雞肝臟apoA-Ⅰ基因m RNA表達(dá)量與體重有顯著的正相關(guān)。apoB是VLDL的重要組成部分,肝臟分泌的apoB對(duì)脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)在apoB基因第26個(gè)外顯子的123位點(diǎn)堿基T同義突變?yōu)镚,同時(shí)終止密碼子500個(gè)堿基之后有9個(gè)堿基的缺失,通過(guò)單核苷酸多態(tài)性和單倍型分析,發(fā)現(xiàn)這2處核苷酸多態(tài)性可能與體增長(zhǎng)和脂肪沉積相關(guān)。本研究結(jié)果表明,AA肉雞和北京油雞之間肝臟apoB基因mRNA表達(dá)量的差異并未達(dá)到顯著水平。

脂聯(lián)素是哺乳動(dòng)物脂肪組織中大量表達(dá)的脂肪細(xì)胞因子[19],在脂肪和碳水化合物的代謝過(guò)程中起重要作用。與哺乳動(dòng)物不同,M addineni等[20]研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素基因在雞體內(nèi),除了在脂肪組織中大量表達(dá)外,在肝臟、間腦、垂體前葉、腎臟、卵巢、脾臟、骨骼肌中都有表達(dá),并且肝臟的表達(dá)量?jī)H次于脂肪。肝臟是禽類脂肪合成的主要器官,因此本文比較了AA肉雞和北京油雞肝臟和脂肪組織脂聯(lián)素的表達(dá)情況。人類醫(yī)學(xué)研究表明:血漿脂聯(lián)素濃度與體形參數(shù)和內(nèi)臟脂肪沉積負(fù)相關(guān)[21-22],肥胖病人和小鼠的脂聯(lián)素基因m RNA水平均低于正常個(gè)體[23]。但是本研究結(jié)果并不能得出完全一致的結(jié)論,AA肉雞的血漿脂聯(lián)素濃度顯著低于北京油雞,與之相應(yīng)的是體重顯著高于北京油雞,56日齡時(shí)腹脂率高于北京油雞。同在上市日齡,AA肉雞的體重是北京油雞的將近2倍,但是腹脂率僅為北京油雞的1/2左右,此時(shí),AA肉雞腹脂脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量顯著低于114日齡北京油雞,而肝臟脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量顯著高于114日齡的北京油雞。相關(guān)分析結(jié)果表明,腹脂脂聯(lián)素基因表達(dá)量與體重負(fù)相關(guān)（r=-0.35,P=0.09）,而與腹脂率正相關(guān)（r=0.39,P=0.07）,但是均未達(dá)到顯著水平。由于禽類的脂聯(lián)素在多個(gè)組織中表達(dá),體增長(zhǎng)和脂肪沉積可能受到各個(gè)組織表達(dá)量的綜合影響,在此我們僅探討了2個(gè)品種間肝臟和脂肪組織的表達(dá)差異。

激素敏感脂酶（HSL）一直被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞脂動(dòng)員過(guò)程中唯一的脂肪水解限速酶,但是HSL基因敲除鼠的出現(xiàn)揭示了另一個(gè)脂肪分解酶的重要作用,即ATGL是啟動(dòng)脂肪動(dòng)員,催化甘油三酯第1步水解的關(guān)鍵酶,并證明了ATGL催化甘油三酯水解為甘油二酯,但不水解膽固醇或者視黃酯[7]。目前關(guān)于ATGL對(duì)雞脂肪沉積的影響研究鮮有報(bào)道,本研究初步比較了不同品種肉雞的腹脂ATGL基因m RNA表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)AA肉雞腹脂ATGL基因m RNA表達(dá)量顯著高于北京油雞,提示AA肉雞腹脂脂肪動(dòng)員可能比北京油雞活躍,從而導(dǎo)致品種間腹脂沉積量的差異。

H-FABP基因及A-FABP基因是影響IM F含量的候選基因[5-6]。H-、A-FABP屬于FABPs家族,是參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的攝取,并協(xié)助其運(yùn)輸?shù)囊环N蛋白質(zhì)。作為細(xì)胞內(nèi)脂肪酸及其輔酶A的貯存庫(kù),FABPs能夠在較大范圍內(nèi)以脂肪酸濃度的方式來(lái)調(diào)控機(jī)體內(nèi)的脂類代謝過(guò)程[24-25]。本研究結(jié)果表明AA肉雞H-FABP基因m RNA表達(dá)量顯著高于北京油雞,A-FABP基因mRNA表達(dá)量顯著低于北京油雞。體重與H-FABP基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān),與A-FABP基因m RNA表達(dá)量在0.10的水平上負(fù)相關(guān)。值得注意的是,當(dāng)相同日齡比較時(shí),H-FABP基因m RNA表達(dá)量與腹脂率和IM F沉積正相關(guān),但是與上市日齡比較時(shí),卻表現(xiàn)為顯著的負(fù)效應(yīng)。A-FABP基因m RNA表達(dá)量與腹脂率顯著正相關(guān),推測(cè)A-FABP基因是造成2個(gè)品種腹脂沉積量差異的關(guān)鍵基因之一。

PPARs屬于激素核受體家族,可直接參與細(xì)胞脂類代謝,并能調(diào)控多種參與細(xì)胞脂類代謝的目的基因[3]。PPARα和PPARγ是PPARs家族的2個(gè)亞型,本研究中PPARα在品種間沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的差異。PPARγ協(xié)同C/EBP（CCAAT）轉(zhuǎn)錄因子影響脂肪酸在脂肪組織中的貯存,能誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞成熟為脂肪細(xì)胞,是脂肪細(xì)胞分化的一部分[16]。本研究發(fā)現(xiàn),56日齡的北京油雞PPARγ基因m RNA表達(dá)量顯著高于56日齡AA肉雞和114日齡北京油雞,但是上市日齡的AA肉雞和北京油雞之間沒(méi)有顯著差異。

脂肪代謝是一個(gè)多基因、多途徑的復(fù)雜過(guò)程。目前單個(gè)基因多態(tài)性和基因表達(dá)對(duì)脂類代謝的影響研究較多,但是代謝通路上各個(gè)基因之間的相互影響及調(diào)控機(jī)制并不明了。本研究通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),雞腹脂ATGL基因、PPARα基因、肝臟apoA-Ⅰ基因和脂聯(lián)素基因m RNA表達(dá)量均與腹脂H-FABP基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān),同時(shí)肝臟中apoA-Ⅰ基因m RNA表達(dá)量與脂聯(lián)素基因mRNA表達(dá)量顯著正相關(guān),提示H-FABP是脂類代謝通路上的關(guān)鍵基因。肝臟脂聯(lián)素基因、apoB基因以及腹脂ATGL基因m RNA表達(dá)量與腹脂PPARα基因m RNA表達(dá)量顯著正相關(guān),也說(shuō)明PPARα基因可能是代謝通路中處于調(diào)控節(jié)點(diǎn)的基因。這些基因表達(dá)水平之間的關(guān)系為進(jìn)一步深入研究脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

①北京油雞血漿LPL和MDH活性高于AA肉雞,從而導(dǎo)致較高的血漿TG和FFA濃度,可能是北京油雞脂肪沉積較高的內(nèi)在因素之一。

②A-FABP基因是造成2個(gè)品種腹脂沉積量差異的關(guān)鍵基因,H-FABP是脂類代謝通路上的關(guān)鍵基因。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:w enj@iascaas.net.cn

（編輯 何麗霞）