路則慶 羊雪芹 靳明亮 曹 煜 汪以真*

（1.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所,生物飼料安全與污染防控國家工程實驗室,動物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點實驗室,杭州 310029; 2.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,杭州 310036）

細菌多糖具有無毒高效、理化性質(zhì)獨特、易于分離等優(yōu)良特性,并且可通過深層發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[1-2],另外,細菌多糖生產(chǎn)周期短,不易受季節(jié)、地域和病蟲害等自然環(huán)境的限制[3],因此具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。多糖作為在生命活動中起核心作用的基本物質(zhì),具有控制細胞分裂和分化,調(diào)節(jié)細胞生長與衰老等復(fù)雜生物功能。同時,作為一種免疫調(diào)節(jié)劑,多糖能激活巨噬細胞,活化并促進T淋巴細胞轉(zhuǎn)化,提高B淋巴細胞和NK細胞的數(shù)量與活性[4];此外,多糖還具有誘導(dǎo)白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素等細胞因子的產(chǎn)生及其受體的表達,活化補體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑和變更途徑等作用[5]。

目前國內(nèi)報道具有免疫調(diào)節(jié)活性或抗腫瘤作用的多糖主要有靈芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖、銀耳多糖和金針菇多糖等,對細菌多糖的研究還不夠深入。本試驗通過探討Z 0206細菌蛋白多糖對大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用,為其進一步在畜禽上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù),對推動安全、高效的畜禽免疫增強劑的研制具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Z 0206細菌蛋白多糖由本實驗室篩選的產(chǎn)多糖菌株E.cloacaeZ 0206發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過離心除菌體、乙醇沉淀、乙醚丙酮洗滌等分離純化過程制備而成[6]。其中糖含量為35.05%,多糖主要成分由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成,摩爾比分別為6.860︰0.455︰1.180,平均分子量為23 928 u,包含α和β2種糖苷鍵,存在吡喃糖環(huán)構(gòu)型[7]。

血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）檢測試劑盒,補體單體成分C3、C4檢測試劑盒,溶菌酶檢測試劑盒,TNF-α、IL-2和IL-6放射免疫分析試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

將40只清潔級SD大鼠隨機分為4組,每組10只（雌雄各占1/2）。其中1組為對照組,飼喂基礎(chǔ)飼糧,其余為試驗組,分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.2%、0.4%和0.8%的Z 0206細菌蛋白多糖。試驗基礎(chǔ)飼糧參照試驗動物飼糧配方AIN-93G（Nutrient Requirem entof Laboratory Animal,Fourth Revised Edition,1995）配制而成,配制的飼糧經(jīng)Co60放射殺菌密封低溫保存。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗大鼠在溫度20～25℃,相對濕度40%～70%的隔離環(huán)境中飼養(yǎng),自由采食、飲水,預(yù)試期5 d,正試期28 d。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,大鼠禁食（自由飲水）12 h,眼眶靜脈叢采血,頸椎脫臼處死,取樣檢測相關(guān)免疫指標。

1.2.3 檢測指標及方法

免疫器官指數(shù):試驗結(jié)束時,先稱量大鼠的活體重,大鼠頸椎脫臼處死后無菌摘取脾臟和胸腺,用濾紙吸去血液,用眼科剪剪去脂肪和系膜后稱重,計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[8-9]。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重（g）/體重（kg）。

部分血清免疫指標:大鼠眼眶靜脈叢采血于無菌離心管中,于37℃水浴中靜置,上層血清析出后, 3 000 r/min離心10m in,吸取上清,分裝于Eppendorf管保存于-70℃低溫冰箱,測定血清免疫指標。血清IgA、IgG和IgM,血清C3、C4含量采用免疫比濁法在Daytona全自動生化分析儀上測定;血清溶菌酶活性采用比濁法在Pharmacia Biotech分光光度計上測定;血清細胞因子TNF-α、IL-2和IL-6含量采用放射免疫法在西安262廠XH 6080放免儀上測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析,組內(nèi)和組間比較采用單因素方差分析,結(jié)果以平均值±標準差表示,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 細菌蛋白多糖對大鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表1可知,與對照組相比,飼糧中添加0.4%和0.8%的Z0206細菌蛋白多糖顯著提高了大鼠脾臟和胸腺指數(shù)（P＜0.01）,2個試驗組間差異不顯著（P＞0.05）,而0.2%添加組大鼠免疫器官指數(shù)無明顯改善（P＞0.05）。

表1 Z0206細菌蛋白多糖對大鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of p roteoglycan Z0206 on immune organ indices in rats g/kg

2.2 細菌蛋白多糖對大鼠血清免疫球蛋白含量的影響

由表2可知,飼糧中添加不同劑量的Z 0206細菌蛋白多糖可提高大鼠血清免疫球蛋白含量。與對照組相比,0.2%、0.4%和0.8%添加組大鼠血清IgA含量分別提高了22.9%（P＜0.01）、41.3% （P＜0.01）和13.8%（P＜0.05）;血清IgM含量分別提高5.4%（P＜0.05）、10.8%（P＜0.05）和5.4%（P＜0.05）;而血清IgG含量只有0.4%添加組顯著提高（P＜0.05）。

表2 Z0206細菌蛋白多糖對大鼠血清免疫球蛋白含量的影響Table 2 Ef fect of proteoglycan Z0206 on concentrations of serum immune globulins in rats g/L

2.3 細菌蛋白多糖對大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影響

由表3可見,與對照組相比,各試驗組大鼠血清C3含量均顯著提高（P＜0.05）,血清C4含量也有提高的趨勢,但差異不顯著（P＞0.05）;0.2%、 0.4%和0.8%添加組大鼠血清溶菌酶活性分別提高了64.0%（P＜0.01）、99.3%（P＜0.01）和64.4%（P＜0.01）,其中,0.4%添加組大鼠血清溶菌酶活性顯著高于其他各試驗組（P＜0.01）。

表3 Z0206細菌蛋白多糖對大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影響Tab le 3 Effect o f proteog lycan Z0206 on C3,C4 concentration and lysozyme ac tivity in serum of rats

2.4 細菌蛋白多糖對大鼠血清細胞因子含量的影響

由表4可見,飼糧中添加不同劑量的Z 0206細菌蛋白多糖對大鼠血清細胞因子分泌有促進作用。與對照組相比,各試驗組大鼠血清IL-2含量分別提高了87.4%（P＜0.01）、89.2%（P＜0.01）和22.7%（P＞0.05）;血清IL-6含量分別提高了39.4%（P＜0.01）、48.1%（P＜0.01）和37.5% （P＜0.01）;此外,0.2%和0.4%添加組大鼠血清TNF-α含量比對照組提高了132.3%（P＜0.01）和208.2%（P＜0.01）。

表4 Z0206細菌蛋白多糖對大鼠血清中細胞因子含量的影響Table 4 Effect of proteoglycan Z0206 on concentration of serum cytokines in rats

3 討 論

3.1 細菌蛋白多糖對大鼠免疫器官指數(shù)的影響

多糖分子通過活性中心與細胞表面的多糖受體結(jié)合進入細胞,并且聚集在脾臟等器官[10]。羊雪芹等[11]研究發(fā)現(xiàn),Z 0206細菌富硒多糖可以顯著提高小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)。帥學(xué)宏等[12]的研究發(fā)現(xiàn)鬼臼多糖對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)亦有顯著的提高作用。本研究結(jié)果表明,Z0206細菌蛋白多糖可以提高大鼠脾臟和胸腺指數(shù),與上述研究結(jié)果一致,其中0.4%和0.8%添加組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著提高。

3.2 細菌蛋白多糖對大鼠血清免疫球蛋白含量的影響

免疫球蛋白是機體內(nèi)存在的一類廣泛參與體液免疫反應(yīng)的球蛋白,具有抗菌、抗病毒、激活補體等生物學(xué)功能。Li等[13]探討了米糠多糖對雛雞免疫功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)米糠多糖能促進雛雞血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量;胡曉蕾等[14]的研究發(fā)現(xiàn),在SD大鼠的飼糧中添加不同濃度的白術(shù)多糖,能提高其血清免疫球蛋白水平。本研究也發(fā)現(xiàn),SD大鼠飼糧中添加Z 0206細菌蛋白多糖能增加血清IgA、IgG和IgM的含量,其中以0.4%添加組效果最為顯著。

3.3 細菌蛋白多糖對大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影響

補體是特異性免疫的組成成分,是一組不耐熱具有酶活性的球蛋白,激活后具有細胞溶解、免疫調(diào)節(jié)、中和病毒等生物學(xué)效應(yīng)。溶菌酶主要是由單核吞噬細胞釋放,可作為吞噬系統(tǒng)功能的指標,吞噬細胞是免疫系統(tǒng)一類重要的輔助細胞,具有遞呈抗原的作用。夏雪雁等[15]研究當(dāng)歸多糖活性時發(fā)現(xiàn),給小鼠口服黃芪多糖可提高其補體C3含量;李同洲等[16]研究發(fā)現(xiàn),在仔豬飼糧中添加450 mg/kg的香菇多糖對血清C4含量影響不顯著;鄧超等[17]探討茶樹菇多糖對小鼠免疫功能的影響時也發(fā)現(xiàn),無論是菌絲體茶樹菇多糖還是發(fā)酵液茶樹菇多糖都能在一定程度上提高小鼠溶菌酶活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加Z0206細菌蛋白多糖對大鼠血清C3有顯著提高作用,但對血清C4分泌沒有顯著促進效果,提示Z 0206細菌蛋白多糖是通過替代和經(jīng)典2種途徑來激活補體系統(tǒng)的,但對經(jīng)典途徑促進作用不明顯;Z0206細菌蛋白多糖對大鼠血清溶菌酶活性有顯著提高作用,其中0.4%添加組大鼠血清溶菌酶活性顯著高于其他各處理。

3.4 細菌蛋白多糖對大鼠血清細胞因子含量的影響

細胞因子是由免疫細胞及相關(guān)細胞產(chǎn)生的一類多功能蛋白質(zhì)多肽分子,包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子（TNF）等,主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng),刺激造血功能,并參與組織修復(fù)等。陳清華等[18]探討了牛膝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),牛膝多糖可以促進仔豬血清細胞因子TNF、IL-1、IL-2和IL-6的分泌;牛曉暉等[19]給小鼠投喂云芝多糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠細胞因子IL-1、IL-2、IFN-γ和TNF的含量有所提高,其中IL-2和IFN-γ的活力值明顯高于空白對照,且呈良好的劑量依賴關(guān)系。本試驗研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Z 0206細菌蛋白多糖添加量為0.2%和0.4%時,大鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α的含量顯著提高,雖然0.8%添加組上述細胞因子的分泌也有所增加,但相比于0.4%添加組反而有下降趨勢。

4 結(jié) 論

①Z0206細菌蛋白多糖可以提高大鼠脾臟和胸腺指數(shù),促進血清IgA、IgG和IgM的分泌,提高血清溶菌酶的活性,促進血清C3分泌,同時還可以提高血清細胞因子IL-2、IL-6和TNF-α的濃度。

②Z 0206細菌蛋白多糖對SD大鼠有一定的免疫調(diào)節(jié)作用,其中以0.4%添加量效果最為顯著。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:yzw ang@zju.edu.cn

（編輯 王智航）