劉文孫士平王丹韓淼淼劉永亮李勇管明*

1山東第一醫(yī)科大學附屬淄博市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（淄博255036）

2浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(杭州310006)

氨基糖苷(Aminoglycoside，AG)抗生素治療常用于治療需氧革蘭氏陰性細菌感染[1]。AG也是導致聽力損失和前庭系統(tǒng)功能障礙的第一種耳毒性物質(zhì)[2-4]。已有研究表明，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在AG耳毒性中起一定作用，AG可在內(nèi)耳內(nèi)產(chǎn)生類ROS自由基(包括氧自由基和氮自由基)。因此，它促進線粒體通透性孔的開放，繼而導致毛細胞（Hair cells,HCs）和神經(jīng)元的永久性損傷，最終導致哺乳動物不可逆的損傷[1,3,5-7]。然而，由于可獲得的內(nèi)耳耳蝸有限以及藥物對動物模型的副作用，藥物耳毒性的細胞和分子機制的研究一直受到阻礙[8-12]。House耳研所建立和鑒定了HEI-OC-1細胞(House Ear Institute Organ of Corti 1cells），這些細胞表達許多耳蝸毛細胞的標志物，包括calbin‐din、calmodulin、math1、myosin7a、prestin 9[13-16]。目前，HEI-OC-1細胞系因其簡單易行而被廣泛應用于許多聽覺研究中[17-21]。然而，在聽覺研究中，HEI-OC-1細胞系是否提供了一種細胞模型系統(tǒng)來篩選新的藥理藥物潛在的耳毒性或保護耳朵的特性，仍有待于進一步的研究。本研究以新霉素為毒劑誘導HEI-OC-1細胞死亡，探討新霉素對HEI-OC-1細胞的損傷機制。根據(jù)我們的結果，新霉素以濃度和時間依賴的方式誘導HEI-OC1細胞死亡。此外，氧化應激參與了HEI-OC-1細胞的凋亡和壞死，新霉素作用后，HEI-OC-1細胞的抗氧化-促氧化平衡被破壞，促進線粒體ROS積累，誘導線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane po‐tential,MMP)丟失，進而誘導HEI-OC-1細胞死亡。這種機制與新霉素在體內(nèi)的損傷耳蝸毛細胞的機制相似。因此，我們認為HEI-OC1細胞系可以提供一種細胞模型系統(tǒng)來研究新霉素等耳毒性藥物對耳蝸毛細胞的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

加州大學洛杉磯分校大衛(wèi)·格芬醫(yī)學院聽覺細胞生物學實驗室的費德里科·卡內(nèi)奇博士親切地贈送了HEI-OC-1細胞系。HEI-OC-1細胞系在用于實驗之前進行了RT-PCR和免疫組織化學檢測，細胞株仍表達多種HCs標記，如Myosin7a和Myo‐sin6a。HEI-OC-1細胞5在含10%胎牛血清和100 IU/ml青霉素的 DMEM(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)中37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 細胞活力測定

采用細胞計數(shù)試劑盒CCK-8(碧云天，中國）評估細胞活力。在96孔板上用新霉素1～ 20 mM處理HEI-OC-1細胞1～ 24 h，每孔加入CCK-8溶液(10μl)，37℃孵育0.5 h，在450 nm BIO-RAD 450 nm波長處測定光密度值。

1.3 免疫熒光

采用 TMRE(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)和Mito-Sox Red(Life Technologies,Waltham,USA)分別測量MMP和ROS。將HEI-OC-1細胞暴露于10 mM新霉素中24 h，然后在新霉素和無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后丟棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌樣品，并在37°C添加TMRE或Mito-Sox Red的DMEM中孵育10 min，染色后，細胞在預溫的PBS中洗滌，用共聚焦顯微鏡(LSM700；Zeiss,Heidenheim,Germany)拍照。TUNEL試劑盒(Roche,Indianapolis,IN,USA)檢測凋亡細胞，完成分組實驗后，HEI-OC-1貼壁細胞，4%PFA室溫固定1 h，封閉液室溫封閉1 h?，F(xiàn)配TUNEL反應體系：取出100μl label solution作為陰性對照（2個），將enzyme solution 50 μl加入剩下的450 μl label solution中混勻。配好的反應液加入到四孔板中，50 μl/孔，37℃孵育1h。去除反應液，PBST洗，加入DAPI染色，室溫20-30 min。PBST洗。封片后熒光顯微鏡觀察拍片，100-200倍，5個視野計數(shù)統(tǒng)計。

1.4 實時定量PCR(qRT-PCR)

用Trizol試劑（碧云天，中國）提取定量實時PCR(qRT-PCR)總 RNA，用 Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)反轉錄制備cDNA。然后，用Bios‐systems CFX96實 時 PCR 儀(Bio-RAD，Hercules，USA)和 SYBR Green(Roche,Basel,Switzerland)進行qRT-PCR。表1顯示引物序列。qPCR條件如下：95°C下20 s；95°C下15 s，62°C下1 min，40個循環(huán)，然后在72°C下延伸20 s，mRNA表達水平歸一化到GAPDH的水平。

表1 PCR引物序列。Table 1 PCR sequences used in the experiments

1.5 流式細胞儀分析

用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)(BD,San Jose,USA)分析細胞凋亡。將HEI-OC-1細胞胰酶消化，用冷PBS洗滌兩次，再以1×106個/ml的濃度懸浮在1倍結合緩沖液中，然后加入5μl Annexin V-FITC和5 μl PI，與100μl細胞輕輕混合，然后在黑暗中RT孵育15 min。隨后，向試管中加入400μl 1倍結合緩沖液。為進行TMRE和Mito-Sox分析，將HEI-OC-1細胞胰酶消化，收集，在含TMRE或Mito-Sox的預溫(37°C)溶液中懸浮10 min，并用PBS洗滌。隨后，用流式細胞儀(FACSCanto，BD，San Jose，USA)對樣本進行分析。

1.6 HEI-OC-1細胞對新霉素作用濃度敏感檢測

將HEI-OC-1細胞接種于48孔板中，分別加入0 mM、1 mM、2 mM、5 mM、10 mM和20 mM的新霉素作用24 h，每組設置3個復孔，用光鏡進行塑料貼壁細胞計數(shù)。將HEI-OC-1細胞接種于96孔板中，分別加入0 mM、1 mM、2 mM、5 mM、10 mM和20 mM的新霉素作用24 h，每組設置3個復孔，采用CCK-8評估細胞活力。

1.7 HEI-OC-1細胞對新霉素作用時間敏感檢測

將HEI-OC-1細胞接種于96孔板中，分別加入10 mM和20 mM的新霉素誘導HEI-OC-1細胞死亡，誘導時間0 h、4 h、8 h、12 h、24 h，每組設置3個復孔，采用CCK-8評估細胞活力。

1.8 新霉素損傷后凋亡細胞和壞死細胞百分比測定

將HEI-OC-1細胞接種于6孔板中，加入0 mM、10 mM新霉素作用24 h每組設置3個復孔。用Annexin V-FITC和PI分析細胞凋亡和壞死。將HEI-OC-1細胞接種于48孔板蓋玻片中，加入0 mM、10 mM新霉素作用24 h，每組設置3個復孔，用TUNEL染色檢測新霉素損傷后HEI-OC-1細胞的凋亡情況。

1.9 經(jīng)新霉素處理后HEI-OC-1細胞的MMP和ROS檢測

將HEI-OC-1細胞接種于48孔板蓋玻片中，加入0 mM、10 mM新霉素作用24 h，每組設置3個復孔，采用TMRE和Mito-Sox Red分別測量MMP和ROS。

1.10 新霉素損傷后，HEI-OC-1細胞的抗氧化-促氧化檢測

將HEI-OC-1細胞接種于6孔板中，加入0 mM、10 mM新霉素作用24 h，每組設置3個復孔，采用qRT-PCR定量分析促氧化因子Alox15和抗氧化因子Gsr和Sod1。

1.11 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 6。對于每個實驗，n代表重復次數(shù)。兩組間比較采用twotailed,unpaired Student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HEI-OC-1細胞對新霉素作用濃度敏感

為探討HEI-OC-1細胞對新霉素的敏感性，將HEI-OC-1細胞以遞增劑量的新霉素作用24 h后，用光鏡和CCK-8試劑進行塑料貼壁細胞計數(shù)，測定細胞存活率。結果發(fā)現(xiàn)，當新霉素劑量超過5 mM時，HEI-OC-1細胞的可塑性貼壁率迅速下降(圖 1A，B)。此外，CCK-8 檢測結果還表明，HEIOC-1細胞對新霉素劑量敏感。隨著新霉素劑量的增加，細胞存活率顯著降低，1 mM、2 mM、5 mM、10 mM和20 mM處理24 h后，存活率分別為82.7±5.1%、77.2±3.1%、71.9±5.1%、56.3±7.3% 和47.2±5.8%(圖1C)。新霉素在10 mM-20 mM作用24 h后，HEI-OC-1細胞出現(xiàn)50%死亡率(圖1B，C)。

2.2 HEI-OC-1細胞對新霉素作用時間敏感

選用10 mM和20 mM的新霉素誘導HEI-OC-1細胞死亡，誘導時間0～ 24 h。CCK-8檢測結果顯示，HEI-OC-1細胞對新霉素作用時間敏感。10 mM新霉素作用4 h、8 h、12 h、24 h后，細胞存活率分別為 88.0±9.8%、84.8±4.5%、76.9±7.3%、56.3±7.3%。在20 mM新霉素處理4 h、8 h、12 h和24 h后，細胞存活率分別為77.8±5.0%、65.7±7.1%、50.8±8.8%、65.7%±7.1%、50.8±8.8%、65.7%±7.1%、50.8±8.8%和56.3%±7.3%(圖1D)。

圖1 HEI-OC-1細胞存活率隨新霉素作用濃度和時間的增加而降低。(A)光鏡下細胞計數(shù)顯示，5 mM以上的新霉素處理后，可塑貼壁的HEI-OC-1細胞明顯減少。(B)5mM、10mM、20 mM新霉素作用24h后，HEI-OC-1細胞存活率分別為72±3.5%、61.1±5.1%、40.8±3.9%，CCK-8檢測結果顯示，隨著新霉素劑量的增加，細胞存活率下降。新霉素在10mM-20 mM作用24 h后，HEI-OC-1細胞出現(xiàn)50%死亡率。(C)CCK-8實驗結果顯示，HEI-OC-1細胞的存活率隨新霉素作用濃度的增加而降低。1 mM、2 mM、5 mM、10 mM和20 mM作用24 h后，CCK-8實驗結果顯示細胞存活率分別為82.7±5.1%、77.2±3.1%、71.9±5.1%、56.3±7.3%和47.2±5.8%。新霉素在10mM-20 mM作用24 h后，HEIOC-1細胞出現(xiàn)50%死亡率。(D)CCK-8實驗結果顯示，HEI-OC-1細胞的存活率隨新霉素作用時間的延長而降低。10 mM新霉素作用4 h、8 h、12 h和24 h后，HEI-OC-1細胞的存活率分別為88.0±9.8%、84.8±4.5%、76.9±7.3%和56.3±7.3%，20 mM新霉素作用4 h、8 h、8 h和24 h后，細胞存活率分別為77.8±5.0%、65.7±7.1%、50.8±8.8%和47.2±5.8%。*P<0.05。比例尺=100μm.Fig.1 The survival rate of HEI-OC-1 cells decreased as the neomycin treatment dose and time increased.(A)Cell count‐ing under light microscope showed that the plastic adherent HEI-OC-1 cells significantly decreased after neomycin treat‐ment at a dose of over 5 mM.(B)The survival rates of HEIOC-1 cells were 72±3.5%,61.1±5.1%and 40.8±3.9%,respec‐tively,after neomycin treatments at 5 mM,10 mM and 20 mM for 24 h.And neomycin treatments at 10-20 mM for 24 h led to CD50 of HEI-OC-1 cells.(C)Results of CCK-8 assay showed that the survival rate of HEI-OC-1 cell decreased with the increase in neomycin dose.That the survival rates of HEI-OC-1 cells were 82.7±5.1%,77.2±3.1%,71.9±5.1%,56.3±7.3%and 47.2±5.8%,respectively,after neomycin treat‐ments at 1 mM,2 mM,5 mM,10 mM and 20 mM for 24 h.And neomycin treatments at 10-20 mM for 24 h led to CD50 of HEI-OC-1 cells.(D)Results of CCK-8 assay showed that the survival rate of HEI-OC-1 cells decreased as the neomy‐cin treatment time increased.The statistical chart showed that the survival rates of HEI-OC-1 cells were 88.0±9.8%,84.8±4.5%,76.9±7.3%and 56.3±7.3%,respectively,after 10 mM neomycin treatments for 4 h,8 h,12 h and 24 h.Additionally,the survival rates of HEI-OC-1 cells were 77.8±5.0%,65.7±7.1%,50.8±8.8%and 47.2±5.8%,respectively,after 20 mM neomycin treatments for 4 h,8 h,12 h and 24 h.Data are shown as mean±S.D.*P<0.05.Scale bars=100 μm.

2.3 新霉素損傷后凋亡細胞和壞死細胞百分比增加

不同的有害刺激可通過壞死、凋亡或兩者兼而有之的方式誘導死亡。為了解新霉素誘導HEIOC-1細胞死亡的確切途徑，我們用10 mM新霉素作用于HEI-OC-1細胞24 h，流式細胞儀Annexin-V/PI分析顯示，與未損傷對照組相比，新霉素處理后凋亡和壞死細胞百分率顯著增加(圖2A-D)。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，進一步用TUNEL染色檢測新霉素損傷后HEI-OC-1細胞的凋亡情況。結果，新霉素處理組的TUNEL陽性細胞百分率明顯高于未損傷對照組(圖2E，圖4F)。以上結果表明，新霉素損傷可導致HEI-OC-1細胞凋亡和壞死。

圖2 新霉素處理后凋亡和壞死的HEI-OC-1細胞百分比增加。(A-D)流式細胞儀分析顯示，10 mM新霉素作用24 h后，凋亡細胞和壞死細胞的百分率均明顯高于未損傷對照組。(E和F)TUNEL染色顯示，10 mM新霉素作用24 h后，TUNEL陽性凋亡細胞百分率明顯高于未損傷對照組。*P<0.05。比例尺=20μm。Fig.2 The percentages of apoptotic and necrotic HEI-OC-1 cells increased after neomycin treatment.(A-D)Flow cyto‐metric analysis indicated that the percentages of both apoptot‐ic and necrotic cells significantly increased after 10 mM neo‐mycin treatment for 24 h relative to the undamaged controls.(E and F)TUNEL staining demonstrated that the percentage of TUNEL-positive apoptotic cells significantly increased af‐ter 10 mM neomycin treatment for 24 h relative to the undam‐aged controls.Data are shown as mean±S.D.*P<0.05.Scale bars=20 μm.

2.4 經(jīng)新霉素處理后，HEI-OC-1細胞的MMP降低

線粒體是負責氧化應激反應的主要細胞器，而MMP的減少是線粒體功能障礙的主要特征本研究利用TMRE試劑盒定量檢測HEI-OC-1細胞MMP的變化。免疫熒光結果顯示，與未損傷對照組相比，10 mM新霉素處理24 h后，TMRE強度降低，同時流式細胞儀分析證實，新霉素處理組的MMP明顯低于未損傷對照組(圖3A-C)。以上結果表明，新霉素可降低HEI-OC-1細胞的線粒體膜電位。

圖3 新霉素處理后HEI-OC-1細胞的MMP降低。(A)免疫熒光結果顯示，10 mM新霉素處理組與未損傷對照組相比，MMP明顯降低。(B和C)流式細胞儀分析證實，10 mM新霉素作用24 h后，與未損傷對照組相比，MMP明顯降低。*P<0.05。比例尺=20μm。Fig.3 The MMP decreased in HEI-OC-1 cells after neomy‐cin treatment.(A)The immunofluorescence results showed that the MMP significantly decreased in 10 mM neomycin treatment groups compared with the undamaged controls.(B and C)Flow cytometric analysis confirmed that the MMP sig‐nificantly decreased after 10 mM neomycin treatment for 24 h compared with the undamaged controls.Data are shown as mean±S.D.*P<0.05.Scale bars=20 μm.

2.5 經(jīng)新霉素處理后，HEI-OC-1細胞ROS水平升高

活性氧促進線粒體通透性孔道開放，導致線粒體膜電位丟失。用氧化還原熒光載體Mito-Sox Red選擇性檢測線粒體超氧化物歧化酶(SOD)，檢測10 mM新霉素作用24 h后HEI-OC-1細胞線粒體ROS水平的變化，免疫熒光分析顯示，10 mM新霉素作用24 h后，HEI-OC-1細胞線粒體ROS水平較未損傷對照組明顯升高(圖4A，B)，流式細胞儀檢測結果證實，與未損傷對照組相比，新霉素處理組細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(圖4C，D)。這些結果表明，新霉素可促進HEI-OC-1細胞中ROS的積聚，進而導致HEI-OC-1細胞中MMP的丟失。

2.6 新霉素損傷后，HEI-OC-1細胞的抗氧化-促氧化平衡被破壞

抗氧化-促氧化平衡在細胞氧化還原動態(tài)平衡中起著重要作用，其失衡可能導致活性氧的積累。在此，我們用qPCR方法分析了6個氧化還原相關基因的mRNA表達水平。結果，與未損傷的對照組相比，新霉素處理組的促氧化因子Alox15和抗氧化因子Gsr和Sod1的表達水平均上調(diào)(圖4E)。

圖4 新霉素處理后HEI-OC-1細胞內(nèi)ROS水平升高，抗氧化因子和促氧化因子的正常表達水平受到干擾。(A和B)免疫熒光分析顯示，10 mM新霉素作用24 h后，細胞內(nèi)ROS水平較未損傷對照組升高。流式細胞術(C和D)結果證實，10 mM新霉素處理組與未損傷對照組相比，MMP升高。(E)RT-qPCR分析結果顯示，10 mM新霉素處理組與未損傷對照組相比，促氧化因子Alox15表達上調(diào)。同時，10 mM新霉素作用24 h后，Gsr、Sod1等抗氧化因子也明顯上調(diào)。*P<0.05。比例尺=20μm。Fig.4 The ROS level increased in HEI-OC-1 cells after neo‐mycin treatment,and the normal expression levels of both an‐ti-oxidative factors and prooxidantive factors were disrupted after neomycin treatment.(A and B)Immunofluorescence analysis demonstrated that the ROS level increased after 10 mM neomycin treatment for 24 h compared with the undam‐aged controls.(C and D)Results of flow cytometry verified that the MMP increased in 10 mM neomycin treatment groups compared with the undamaged controls.(E)Results of RT-qP‐CR analysis showed that the pro-oxidative factor Alox15 was up-regulated in the 10 mM neomycin treatment groups com‐pared with the undamaged controls.Meanwhile,the anti-oxi‐dative factors such as Gsr and Sod1 were also up-regulated af‐ter 10 mM neomycin treatment for 24 h.Data are shown as mean±S.D.*P<0.05.Scale bars=20 μm.

3 討論

HEI-OC-1細胞株已被用于研究藥物的耳毒性和耳保護的作用和確切機制[15,16,22,23]。然而，HEIOC-1細胞系能否提供模擬體內(nèi)藥物處理后耳蝸毛細胞病理生理變化的細胞模型體系，還有待進一步研究。本研究以新霉素作為耳毒性藥物誘導HEIOC-1細胞死亡，以闡明新霉素對HEI-OC-1細胞的藥物耳毒性及其損傷機制，并與體內(nèi)耳蝸毛細胞的損傷機制進行比較。我們的研究表明，新霉素以濃度和時間依賴的方式誘導HEI-OC1細胞死亡。新霉素(1～ 20 mM)作用于HEI-OC-1細胞24 h后，細胞存活率明顯下降。此外，10 mM、20 mM新霉素作用于HEI-OC-1細胞1～ 24 h后，細胞存活率也逐漸下降。研究發(fā)現(xiàn)10 mM新霉素作用24 h后，HEI-OC-1細胞死亡約50%～ 60%。我們選擇這種條件來研究新霉素對HEI-OC-1細胞的損傷作用及其機制。

新霉素主要通過在內(nèi)耳產(chǎn)生ROS誘導毛細胞死亡[2,3,24-26]。在新霉素作用下，ROS的積累觸發(fā)線粒體去極化，從而進一步導致MMP的丟失[27-28]。本研究還表明，新霉素可提高HEI-OC-1細胞線粒體ROS水平，降低MMP，提示新霉素通過氧化應激誘導HEI-OC-1細胞死亡，與體內(nèi)機制相似。在生理條件下，由于ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡，ROS水平被維持在一定的范圍內(nèi)，這種平衡是在眾多相互協(xié)調(diào)的基因的作用下保持的[12]。一旦這種平衡被打破，細胞內(nèi)的ROS水平就會增加[29,30]。本研究還發(fā)現(xiàn)，與未損傷對照組相比，新霉素處理組的促氧化因子和抗氧化因子如Alox15、Gsr和Sod1的表達均增加，這種干擾也可能是導致ROS水平升高的原因之一。

綜上所述，我們的結果表明，新霉素以濃度和時間依賴的方式誘導HEI-OC-1細胞死亡，氧化應激參與了HEI-OC-1細胞的凋亡和壞死。新霉素損傷后，HEI-OC-1細胞的抗氧化-促氧化平衡被破壞，促進線粒體ROS積累，誘導MMP丟失，進而誘導HEI-OC-1細胞死亡。這種機制與新霉素在體內(nèi)的損傷機制相似。因此，我們認為HEI-OC1細胞系可以提供一種細胞模型系統(tǒng)來研究新霉素等耳毒性藥物對耳蝸毛細胞的損傷機制。