謝彤 李桂蓮 巨韓芳 趙德福 趙慧 穆成 王擷秀

(天津市結(jié)核病控制中心 天津 300011)

鏈霉素為氨基糖苷類抗生素,主要作用于16s RNA,干擾蛋白質(zhì)的翻譯,抑制蛋白質(zhì)合成。已經(jīng)證實鏈霉素耐藥相關(guān)的基因主要為編碼核糖體蛋白S12的 rpsL基因和編碼16sRNA的 rrs基因。在一些地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)鏈霉素耐藥株的傳播與M TB北京基因型密切相關(guān)[1]。本研究旨在闡明天津地區(qū)鏈霉素耐藥M TB菌株 rpsL和rrs基因突變位點以及突變率是否與北京家族基因型相關(guān)。

1 資料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究中包括116株鏈霉素耐藥菌株和10株全敏菌株,所有菌株均來自于本室保存的2008年1月—2009年6月在天津市結(jié)核病控制中心以及天津市10個區(qū)縣結(jié)防機構(gòu)就診的結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性肺結(jié)核患者。

1.1.2 主要試劑 比例法藥敏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;Probest Taq酶為寶生物工程有限公司產(chǎn)品;細菌基因組提取試劑為上海生工生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 從L-J固體培養(yǎng)基中挑取M TB培養(yǎng)物3～4環(huán)加入盛有400μl 1×TE緩沖液的 Eppendorf管中,80℃60 min滅活后,采用CTAB法M TB基因組提取。

1.2.2 M TB北京基因型鑒定 采用多重PCR方法,根據(jù)其家族菌株基因組中Rv2816至Rv2819序列缺失進行鑒定北京基因。PCR擴增產(chǎn)物片段長度為393 bp即為北京基因型,570 bp為非北京基因型[2]。

1.2.3 rpsL和rrs基因突變分析 PCR分別擴增rpsL和rrs基因。rpsL基因擴增引物為5′-GA TGACGGCCTTCGGGTTGT-3′ 和 5′-GTTCACCAACTGGGTGAC-3′,產(chǎn)物長度為 622 bp;rrs 基因擴 增引物 為 5′-GA TGACGGCCTTCGGGTTGT-3′和 5′-AGGCCACAAGGGAACGCCTA-3′,產(chǎn)物長度為504 bp。PCR反應(yīng)在含有200μmol/L dN TP,0.4μmol/L引物,1.5 mmol/L M gCl2,1.5 U Taq酶和10～100 ng基因組DNA的50μL體系中進行。經(jīng)95℃5min變性后,熱循環(huán)溫度條件為95℃45 s;60℃1min;72℃1min,共30個循環(huán),上海英駿生物技術(shù)有限公司負責(zé)引物合成與PCR產(chǎn)物序列分析。使用在線比對軟件http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi將測序結(jié)果與標準敏感株H37Rv基因序列進行比對,判定基因的點突變位點。

2 結(jié)果

2.1 M TB北京基因型鑒定 在本研究中116株鏈霉素耐藥臨床分離菌株經(jīng)多重PCR分析108株為北京基因型,占全部菌株的93.1%,提示北京基因型為天津地區(qū)流行的鏈霉素耐藥M TB優(yōu)勢菌株。

2.2 rpsL基因突變分析 116株鏈霉素耐藥株中,rpsL基因發(fā)生點突變位點主要集中于43位和88位密碼子(表1)。其中70株(60.3%)發(fā)生 rpsL 43 AAG→AGG(K43R)突變;15株(12.9%)發(fā)生rpsL 88 AA G→A GG(K88R)突變,rpsL基因總突變率為 73.3%(85/116)。此外,所有的耐藥株在121位密碼子均出現(xiàn)AAA-AAG的無意義突變。106株 M TB北京基因型中67(63.2.%)株發(fā)生K43R突變;8株非北京基因型中3(37.5%)株出現(xiàn)K43R突變。K88R的突變類型僅出現(xiàn)在15株北京基因型中,非北京基因型未發(fā)現(xiàn)此類突變類型。K43R與 K88R兩種類型突變頻率在北京基因型和非北京基因型沒有統(tǒng)計學(xué)差異。在全敏菌株中,除一株發(fā)生 AAA-AAG(K121K)無意義突變外,在rpsL基因中未見基因突變。

2.3 rrs基因突變分析 與鏈霉素耐藥相關(guān)的另外一個基因 rrs以513 A→C突變?yōu)橹?2株M TB出現(xiàn)516 C→T。此外,各有1株M TB鏈霉素耐藥株分別出現(xiàn)905 A→G和926 C→G突變(表1)。rrs基因總突變率為14.7%(17/116)。1株菌株rpsL 88和 rrs 926位同時突變。rrs基因突變僅在北京基因型中出現(xiàn),在非北京基因型中未見 rrs突變。

表1 耐藥基因 rpsL和rrs耐藥相關(guān)基因突變特征

3 討論

在我國十省市開展的結(jié)核病耐藥監(jiān)測研究證實鏈霉素耐藥結(jié)核病在我國某些地區(qū)流行較為廣泛[3]。與鏈霉素相關(guān)的 rpsL基因點突變通常發(fā)生在43和88位點。本研究中 K43R的突變頻率為60.3%(70/116),低于新加坡地區(qū)89%[4],但高于Sreevatsan等人早前54%的報道[5]。在88位點天津地區(qū)分離菌株中僅檢測到 K88R突變形式,而未見其他研究中常見的 K88Q和 K88T突變[4,6]。此外,值得關(guān)注的是天津地區(qū)分離的全部鏈霉素耐藥菌株在 rpsL基因121位點均出現(xiàn)了AAA-AAG的無意義突變,而這種突變僅在少量印度流行的耐鏈霉素菌株中出現(xiàn)[7]。

在越南、新加坡等地研究提示鏈霉素耐藥M TB的傳播與北京基因型密切相關(guān)[1,8]。Sun等人的最新研究發(fā)現(xiàn)在北京基因型鏈霉素耐藥株中 rpsL K43R突變比例高達89%,顯著高于非北京非北京基因型(40%),這一結(jié)果提示攜帶 rpsL K43R突變的北京基因型鏈霉素耐藥M TB可能更容易在人群中傳播[4]。作為北京基因型高流行地區(qū),天津流行的流行北京基因型鏈霉素耐藥株中,北京基因型與非北京基因型 rpsL K43R突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此,本研究結(jié)果并不支持Sun等人的推斷。天津地區(qū)鏈霉素耐藥菌株 rrs的突變率為14.7%(17/116),在北京基因型中 rrs的突變以513 A→C為主(11.2%),而俄羅斯報道鏈霉素耐藥北京基因型 rrs突變以516 C→T為主(占17%)[9],以上研究提示即使在不同的北京基因型高流行地區(qū),鏈霉素耐藥M TB傳播機制也并不相同。

綜上,天津地區(qū)流行的鏈霉素耐藥菌株中 rpsL和rrs 2個耐藥相關(guān)基因的總突變率為87.7%(101/116),rpsL的突變率為73.3%(85/116),有K43R和 K88R 2種突變方式,這2種突變形式與北京基因型無顯著相關(guān)性;rrs的突變率為14.7%(17/116),以513 A→C突變?yōu)橹鳌?/p>

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