梁艷 吳雪瓊 李忠明 李寧 張俊仙 陽(yáng)幼榮 白雪娟 余琦侯英 劉翠華 安慧茹 史迎昌 劉銀萍 王博 王蘭 劉成龍

(1.中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 北京 100091;2.上海海規(guī)生物科技有限公司 上海 200436)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)一直是人們關(guān)注的一個(gè)全球性健康問(wèn)題。目前,免疫治療成為結(jié)核病治療的新熱點(diǎn),治療性疫苗的研究與開(kāi)發(fā)成為一個(gè)十分重要的研究方向。前期研究中,我們采用Ag85A和Ag85A/ESAT-6嵌合DNA疫苗治療小鼠耐多藥結(jié)核病模型,發(fā)現(xiàn)Ag85A DNA疫苗治療結(jié)核病具有一定的療效,而Ag85A/ESAT-6嵌合DNA疫苗療效不如Ag85A DNA疫苗[1]。本研究將Ag85A/B嵌合DNA疫苗用于小鼠敏感結(jié)核病的治療,以利福平和草分枝桿菌F.U.36注射液為對(duì)照,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察其治療效果,以期尋找用于治療結(jié)核病的有效疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA疫苗和菌株來(lái)源 pVAX1載體由上海海規(guī)生物科技有公司提供,Ag85A/B嵌合DNA疫苗由上海海規(guī)生物科技有公司純化,Ag85A/B嵌合DNA疫苗和pVAX1載體濃度均為1 mg/ml,純度較高A260/A280=2.06＞1.80,幾乎不含蛋白和RNA。Ag85A/85B嵌合DNA疫苗國(guó)內(nèi)專利號(hào)為201010110247.0;結(jié)核分枝桿菌 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株93025由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;草分枝桿菌F.U.36注射液(烏體林斯)購(gòu)自成都金星健康藥業(yè)有限公司,批號(hào) 00808310,規(guī)格 1.72 μ g/ml。

1.1.2 藥物 利福平膠囊購(gòu)自沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司,批號(hào)0901081,規(guī)格0.15 g。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只15～17 g 6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠敏感結(jié)核病感染模型的制備 每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.4 ml含6.8×104CFU的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株93025菌懸液,制備敏感結(jié)核病模型。

1.2.2 小鼠感染情況 感染后2周,隨機(jī)取10只小鼠進(jìn)行解剖,解剖后肉眼觀察小鼠肺和脾大體病理改變;并進(jìn)行肺和脾的活菌計(jì)數(shù),方法是取小鼠全肺和脾加生理鹽水研磨,加等體積6%NaOH消化30 min后,倍比稀釋取100 μ l接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上,置37℃溫箱培養(yǎng)4周;取小鼠脾加生理鹽水研磨,倍比稀釋后取100 μ l接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上,置37℃溫箱培養(yǎng)4周,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 小鼠感染后,將小鼠隨機(jī)均勻地分為5組,每組10只小鼠。小鼠感染后第3d開(kāi)始治療。治療前稱體質(zhì)量1次;治療后每周稱體質(zhì)量1次。小鼠感染后第3 d開(kāi)始,生理鹽水組(A組)每只小鼠肌肉注射100 μ l生理鹽水;pVAX1載體組(B 組)每只小鼠肌肉注射 100 μ g/100 μ l pVAX1 載體;利福平組(C組)口服利福平(0.02 mg?g-1?d-1);草分枝桿菌F.U.36注射液組(D組)每只小鼠肌肉注射 0.172 μ g/100 μ l草分枝桿菌 F.U.36注射液;Ag85A/B嵌合DNA疫苗組(E組)每只小鼠肌肉注射 100 μ g/100 μ l Ag85A/B 嵌合 DNA 疫苗,各治療組每2周肌肉注射1次,共注射3次。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢查 在治療結(jié)束后2周,將小鼠肺右葉固定于10%中性福爾馬林,石蠟包埋切片,蘇木精/伊紅(HE)染色后,鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.5 肺、肝菌落計(jì)數(shù) 在治療結(jié)束后2周,取小鼠肺左葉稱重,加生理鹽水研磨,加等體積 6%NaOH 消化30 min后,倍比稀釋取100 μ l接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上,置37℃溫箱培養(yǎng)4周,將得到的肺左葉菌落數(shù)根據(jù)肺左葉和全肺的重量換算為全肺菌落數(shù);取部分肝稱重,加生理鹽水研磨,倍比稀釋后取100μ l接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上,置37℃溫箱培養(yǎng)4周,將得到部分肝的菌落數(shù)根據(jù)其重量和全肝的重量換算為全肝菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS6.12軟件處理數(shù)據(jù),定量資料用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn)。

圖1 各組小鼠肺組織病理結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染情況 感染后2周,全肺荷菌量為(5.6±0.48)log;全脾荷菌量為(6.0±0.27)log,小鼠肺臟均有明顯的壞死,脾臟都有腫大。

2.2 肺臟組織病理改變 治療結(jié)束后2周,小鼠肺組織的鏡下病理改變,見(jiàn)圖1。A組肺組織病變嚴(yán)重、廣泛,實(shí)變,肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著,肺泡壁重度腫脹、增厚,可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。B組病變程度比A組稍輕,肺泡壁中度、重度增厚,小部分區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)完整。C組無(wú)病變,肺泡結(jié)構(gòu)完整,清晰,肺泡上皮延續(xù)。D、E組肺組織病變較局限,以肉芽腫樣增生性病變?yōu)橹?3/5區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)完整,清晰,肺泡上皮延續(xù)。病變區(qū)域出現(xiàn)典型的由類上皮細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞組成的結(jié)核肉芽腫。

2.3 肺、肝活菌計(jì)數(shù) 治療結(jié)束后2周,全肺菌落數(shù)由多到少依次是A、B、D、E和C組,分別為(6.41±0.25)log、(6.16 ±0.35)log、(5.65 ±0.52)log、(5.60±0.61)log、(4.30±0.44)log。與 A 組比較,B組肺臟菌落數(shù)略有減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,C、D、E組肺臟菌落數(shù)分別減少 2.11 log、0.76 log和0.81 log(P＜0.01),見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺臟活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

全肝菌落數(shù)由多到少依次是A、B、D、E和C組,分別為(5.53±0.31)log、(5.47±0.29)log、(4.79 ±0.34)log、(4.42±0.78)log、(3.42±0.44)log。與 A組比較,B組肝臟菌落數(shù)略有減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,C、D、E組肝臟菌落數(shù)分別減少了2.11 log、0.74 log和1.11log(P＜0.01),見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 各組小鼠肝臟活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

隨著結(jié)核病重新成為危害全球健康的重要呼吸道傳染病之一,對(duì)該病的防控和治療已成為國(guó)內(nèi)外科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。DNA疫苗在結(jié)核病疫苗的開(kāi)發(fā)中占有重要的地位。DNA疫苗是對(duì)付結(jié)核桿菌感染的有效途徑,它可以產(chǎn)生并長(zhǎng)期維持所需的細(xì)胞免疫應(yīng)答。很多研究表明抗結(jié)核治療結(jié)合免疫治療不僅可提高機(jī)體免疫力,而且可以提高化療效果,縮短療程[5-6]。

1996年Huygen等[2]報(bào)道,用編碼 Ag85復(fù)合物編碼基因免疫小鼠,可誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),抵御活結(jié)核分枝桿菌和BCG的攻擊。Ag85復(fù)合物結(jié)核分枝桿菌和BCG主要的分泌性蛋白,包括3個(gè)組分Ag85A、Ag85B和Ag85C,分別由Ag85A、Ag85B和Ag85C基因編碼。Denis等[3]研究了Ag85A DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠的抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng),證實(shí)Ag85A DNA疫苗免疫可產(chǎn)生更強(qiáng)、更廣泛的T細(xì)胞反應(yīng)和CT L活性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者在結(jié)核DNA疫苗方面進(jìn)行了一系列的研究,其中在Ag85A DNA疫苗上取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果[1-6]。Zhu等[7]用Ag85B DNA疫苗治療C57BL/6小鼠結(jié)核感染模型,發(fā)現(xiàn)Ag85B DNA疫苗也具有治療作用,Ag85B DNA疫苗可引起Th1反應(yīng),產(chǎn)生高濃度IFN-γ和TNF-α,降低肺和脾菌落數(shù)達(dá)1.2和0.7 logs。因此本文構(gòu)建了Ag85A/B嵌合DNA疫苗,用于小鼠敏感結(jié)核病的治療。

本研究發(fā)現(xiàn)：從肺、肝細(xì)菌載量來(lái)看,與生理鹽水組比較,各疫苗組肺臟活菌數(shù)和肝臟活菌數(shù)均有不同程度的減少,尤其是Ag85A/B嵌合DNA疫苗組,肺臟活菌數(shù)和肝臟活菌數(shù)分別減少了0.81 log和1.11 log(P＜0.01),表明Ag85A/B嵌合DNA疫苗對(duì)小鼠結(jié)核病具有顯著的治療作用。從肺臟病損程度和組織病變?cè)u(píng)價(jià),Ag85A/B嵌合DNA疫苗組有明顯的療效,與生理鹽水組和載體組病變嚴(yán)重、廣泛相比,疫苗組肺臟病變均有明顯減輕,病變局限,3/5區(qū)域可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)完整,清晰,且與肺菌落計(jì)數(shù)相一致。以上研究結(jié)果表明：Ag85A/B嵌合DNA疫苗具有較好的療效,Ag85A/B嵌合DNA疫苗有望成為治療結(jié)核病新的免疫制劑,給臨床上因耐藥而無(wú)藥可治的結(jié)核病患者帶來(lái)曙光。

[1] Liang Y,Wu XQ,Zhang JX,Li N,Yu Q,Yang YR,Bai XJ,Liu CL,Shi YC,Liu Q L,Zhang PJ,Li ZM.The treatment of mice infected with multi-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using DNA vaccines or in combination with rifampin[J] .Vaccine,2008,26(35)：4536-4540.

[2] Huygen K,Content J,Denis O,Montqomery DL,Yawman AM,Deck RR,DeWitt CM,Orme IM,Baldwin S,D'Souza C,Drowart A,Lozes E,Vandenbussche P,Van Vooren JP,Liu MA,Ulmer JB.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine[J] .Nat Med,1996,2(8)：893-898.

[3] Denis O,T ang he A,Palfliet K,Jurion F.,vandenBerg TP,Vanonckelen A,Ooms J,Saman E,Ulmer JB.,Content J,Huygen K.Vaccination with plasmid DNA encoding mycobacterial antigen 85A stimulates a CD4+and CD8+T cell epitopic repertoire broader than that stimulated by M.tuberculosis H37Rv infection[J] .Infect Immun,1998,6(4)：1527-1533.

[4] 吳雪瓊,張俊仙,李洪敏,史迎昌,張靈霞,梁建琴,金關(guān)甫,由昆.結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗免疫治療作用的研究[J] .中國(guó)免疫學(xué)雜志,2002,18(1)：17-22.

[5] Ha SJ,Jeon BY,Kim SC,Kim DJ,Song M K,Sung YC,Cho SN.Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice with Mycobacterium tuberculosis[J] .Gene T herapy,2003,10(18)：1592-1599.

[6] Ha SJ,Jeon BY,Youn JI,Kim SC,Cho SN,Sung YC..Protective effect of DNA vaccine during chemotherapy on reactivation and reinfection of Mycobacterium tuberculosis[J] .Gene Therapy,2005,12(7)：634-638.

[7] Zhu D,Jiang S,Luo X.Therapeutic effects of Ag85B and MPT 64 DNA vaccines in a murine model of Mycobacterium tuberculosis infection[J] .Vaccine,2005,23(37)：4619-4624.