曹廷明 賈紅彥 古淑香 鄭曉靜 李自慧 杜鳳嬌 劉洋 劉忠泉 邢愛英 杜博平 馬玙 張宗德

(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

結(jié)核病是單一致病菌引起成年人死亡的主要原因,據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年全球約有900萬(wàn)新發(fā)病例,300萬(wàn)人死亡,死亡人數(shù)居單一傳染病之首[1]。缺乏針對(duì)結(jié)核病的早期、快速、靈敏、特異的診斷技術(shù)仍然困擾著結(jié)核病防控工作。目前,結(jié)核病的診斷在診斷標(biāo)志物和診斷技術(shù)等方面還存在很多空白。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)特別是生物信息學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展,為開發(fā)新的結(jié)核病診斷標(biāo)志物和診斷技術(shù)提供了可能和極大的便利。結(jié)核分枝桿菌Rv2352c基因是本課題組利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等方法篩選出來(lái)的特異性基因之一。2008年9月本研究構(gòu)建了Rv2352c基因的高效原核表達(dá)載體,表達(dá)獲得目的蛋白,并對(duì)Rv2352c蛋白的抗原性進(jìn)行了研究,旨在為結(jié)核病的診斷和防治的靶抗原篩選奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 質(zhì)粒p GEM?-T Easy購(gòu)自p romega公司、p ET30a(+)由病毒所李琳琳博士惠贈(zèng)。宿主菌DH5α、BL21(DE3)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv)為本研究室保存。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、His-tag Antibody、DNA及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京天根時(shí)代生物公司。Amp、Kan、IPTG及尿素購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。限制性內(nèi)切酶Bam H I、Xho I及 T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均由Q IA GEN生物工程公司提供。硝酸纖德維素膜(NC)、HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG、HRP標(biāo)記的羊抗人 IgG、IgM、IgA及DAB顯色試劑,購(gòu)自武漢博士德公司。Ni-N TA蛋白純化樹脂購(gòu)自 Novagen公司。蛋白定量試劑盒購(gòu)于普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) Genebank公布的結(jié)核分枝桿菌Rv2352c全基因序列設(shè)計(jì)如下引物,上游:5′-CGGGA TCCGGTGGTGGTA TGA TTTTGGA TTTTTCGTGG-3′,含 Bam H I酶切位點(diǎn) ;下游 :5′-CCGCTCGA GTCCGA TCCCGACCCGCGG-3′, 含Xho I酶切位點(diǎn)。相關(guān)引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.4 Rv2352c基因的擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化 以結(jié)核分枝桿菌 H37Rv菌株的基因組DNA為模板,采用PCR方法擴(kuò)增得到 Rv2352c基因片段。100 ul PCR反應(yīng)體系中加入:2 ul模板,6 ul dN TP(各2.5mmol/L),10 ul Buffer(10X),1 ul上游引物,1 ul下游引物,0.5 ul(5 unit/ul)聚合酶,79.5 ul ddH2O;PCR反應(yīng)條件:95℃5 min,94℃45S,60℃45S,72℃2m in,72℃10m in,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化,操作方法按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 重組表達(dá)載體p ET30a(+):rv2352c的構(gòu)建及鑒定 將目的基因的 PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體(p ET30a)用限制性內(nèi)切酶Bam H I和 Xho I分別進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳法回收純化含粘性末端的rv2352c DNA片段及p ET30a(+)5 500 bp的大片段酶切產(chǎn)物,構(gòu)建p ET30a(+):rv2352c重組體;轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,用含30mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基篩選重組子。對(duì)挑取的重組載體進(jìn)行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,得到有正確插入片段的克隆,隨后對(duì)雙酶切驗(yàn)證正確的克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序檢驗(yàn)正確后,將陽(yáng)性重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3)。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式 挑取含重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落,并接種2m l LB培養(yǎng)基中,37℃過(guò)夜培養(yǎng),隨后以1∶50的比例將過(guò)夜培養(yǎng)菌重新接種于LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8左右時(shí),用終濃度為0.8mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),37℃,200轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)3 h,隨后收集菌體,將收集的菌體沉淀用30～100μl 10 mM Tris-HCl(p H 8.0)緩沖液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定),加入與緩沖液等體積的2×溴酚藍(lán)Buffer,100℃煮5 m in,進(jìn)行 SDS-PA GE電泳檢測(cè)。另取100μl超聲(500W,30次,每次10 s,間隔15 s)后的菌懸液,13 000轉(zhuǎn)/m in,離心10m in,取50 μl上清至另一 EP管,加 50μl 2×溴酚藍(lán)Buffer,100℃煮5 min,電泳,上清去除干凈后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液吹散,加入50μl 2×溴酚藍(lán)Buffer,100℃煮5 m in,SDS-PA GE電泳。

1.7 目的蛋白的純化及鑒定 挑選有表達(dá)的克隆,接1～2μl活化的菌液到250m l LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200轉(zhuǎn)/min,過(guò)夜培養(yǎng)。第2 d取過(guò)夜培養(yǎng)的250 m l菌液與等體積LB液體培養(yǎng)基混合,37℃,200轉(zhuǎn)/min,培養(yǎng)至 OD=0.6～0.8,IPTG誘導(dǎo)(125μl(0.8M)IPTG/250 m l菌液),2.5 h后收菌。大量收菌:用400 m l大離心筒,6 000轉(zhuǎn)/min,離心5m in。棄上清。超聲破菌:沉淀用20～30 m l 10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液吹散,超聲。收集超聲離心后上清和沉淀。Ni柱純化:用純水洗柱,至p H 7.0。掛鎳,至p H 2～3。純水洗柱至p H 7.0。10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約 100 m l。含0.5M氯化鈉的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約50 m l。含8M尿素,0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約50 m l。稀釋樣品(沉淀)上樣。樣品需要事先加入氯化鈉,終濃度為0.5M。上樣結(jié)束后,用含8M尿素,0.5M氯化鈉的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液洗柱。分別用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)(含8M尿素、0.5M氯化鈉的)溶液洗脫,分別收集蛋白峰。SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純化效果。

1.8 目的蛋白的抗原性鑒定 采用Western blot法:將重組蛋白進(jìn)行SDS-PA GE,隨后以100 m A穩(wěn)流電轉(zhuǎn)1.5 h,將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上,用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h,PBST洗膜3次,每次5min。將PVDF膜浸于1∶100稀釋的結(jié)核病人血清中室溫孵育2 h,洗膜3次后,再與1∶2 500的 HRP標(biāo)記的羊抗人 IgG室溫反應(yīng)1 h,洗膜同上。最后,將PVDF膜浸入DAB顯色液中染色,以蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.9 Rv2352c的多克隆抗體的制備及鑒定 取體質(zhì)量2～3 kg的2只新西蘭白兔,皮下初次免疫免疫劑量為200 ug蛋白/只,2周后再進(jìn)行連續(xù)3次加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔為1周,加強(qiáng)免疫的劑量為為200μg蛋白/只。最后1次加強(qiáng)免疫兩周之后,耳靜脈取血,采用間接 ELSIA法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,隨后頸動(dòng)脈取血,離心收集多抗血清,共收集60m l,即Rv2352c蛋白相應(yīng)的兔抗血清。將獲得的抗血清用結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCL,p H 7.5 100mmol/L NaCl)稀釋后,經(jīng)過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾,加樣到IgG親和層析柱中,用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸-HCL,p H 2.5)洗脫后,收集洗脫峰。以本課題組前面制備的 Rv2352c蛋白作為抗原,進(jìn)行 Western blo t檢測(cè),一抗為 1∶2 000稀釋的Rv2352c多克隆抗體,二抗為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,ECL法(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌rv2352c基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得結(jié)核分枝桿菌rv2352c基因序列,以PCR方法擴(kuò)增1 176 bp大小的rv2352c基因產(chǎn)物(圖1)。

圖1 rv2352c基因的PCR產(chǎn)物

將獲得的構(gòu)建p ET30a(+):rv2352c陽(yáng)性重組體用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和XhoⅠ分別進(jìn)行雙酶切,雙酶切圖譜顯示其中的一個(gè)片段大小與目的基因相似(圖2)。對(duì)雙酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證實(shí)p ET30a(+):rv2352c構(gòu)建成功。

圖2 p ET30a(+):rv2352c的酶切鑒定

2.2 重組蛋白 Rv2352c在大腸桿菌BL 21(DE3)中的表達(dá)和純化 將陽(yáng)性重組載體p ET30a(+):rv2352c轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3),挑選有表達(dá)的克隆并進(jìn)一步培養(yǎng),制備培養(yǎng)菌的蛋白提取物,并分為上清液和沉淀物 2個(gè)部分。進(jìn)一步的 SDSPAGE電泳結(jié)果顯示,rv2352c重組表達(dá)蛋白主要在沉淀物中(圖3),說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白以不溶性包涵體形式存在于胞質(zhì)中。

圖3 重組蛋白在BL21(DE3)菌中表達(dá)的SDS-PAGE鑒定

用Ni柱純化重組蛋白的提取物,收集純化產(chǎn)物,隨后的SDS-PA GE電泳結(jié)果顯示已經(jīng)獲得較高純度的重組蛋白R(shí)v2352c(圖4)。

圖4 Ni柱純化重組蛋白收集物純度的SDS-PAGE電泳鑒定

2.3 重組蛋白 Rv2352c的抗原性鑒定 重組蛋白R(shí)v2352c可與結(jié)核病人血清在大約45 kD處,產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)條帶(圖5)。提示該蛋白具有抗原性,在其宿主人體內(nèi)很可能存在相對(duì)應(yīng)的抗體。

2.4 重組蛋白 Rv2352c抗血清的效價(jià)測(cè)定及其多克隆抗體特異性鑒定 采用間接 ELSIA法對(duì)重組蛋白R(shí)v2352c抗血清的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果表明獲得了高效價(jià)的抗 Rv2352c多克隆抗體,兔抗血清的滴度高達(dá)1∶25 600(圖6)。

圖5 Rv2352c與結(jié)核病人血清進(jìn)行蛋白免疫印記分析

圖6 Rv2352c的免抗血清的效價(jià)測(cè)定

將重組蛋白 Rv2352c抗血清用 IgG親和層析柱進(jìn)行純化,獲得重組蛋白R(shí)v2352c的純化多克隆抗體,隨后進(jìn)行Western blot的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)此多克隆抗體能夠與重組蛋白R(shí)v2352c進(jìn)行免疫反應(yīng),條帶位置與純化的Rv2352c重組蛋白一致,說(shuō)明此抗體能夠特異性的與 Rv2352c重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng),可能能夠用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的Rv2352c蛋白(圖 7)。

3 討論

近年來(lái),由于多重原因造成結(jié)核病重新流行,再次成為嚴(yán)重的公共健康問題;特別是艾滋病和結(jié)核病的合并感染以及耐藥結(jié)核病感染者持續(xù)增多,使得這一形勢(shì)更加惡化,給結(jié)核病的防治帶來(lái)新的挑戰(zhàn)[2],結(jié)核病的基礎(chǔ)和臨床越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視。長(zhǎng)期以來(lái),由于缺乏快速、敏感的結(jié)核病診斷技術(shù)和方法,使得難以及時(shí)篩選出結(jié)核病的潛伏感染病例和早期病例,造成結(jié)核病人漏診、診斷時(shí)間延長(zhǎng)或誤診,使結(jié)核病不斷傳播?，F(xiàn)有的診斷方法不能滿足結(jié)核病預(yù)防、控制的需要,因此迫切需要開發(fā)研制出新型快速、靈敏、特異的結(jié)核病診斷方法和技術(shù)。

圖7 Rv2352c與其多抗的Western blot

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化,結(jié)核分枝桿菌已進(jìn)化為非常成功的一種致病菌。結(jié)核分枝桿菌通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體后,侵入肺泡的結(jié)核分枝桿菌被吞噬細(xì)胞吞噬,結(jié)核分枝桿菌主要寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi),并通過(guò)其逃逸機(jī)制逃避免疫殺傷,在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活而造成持留(persist)[3]。結(jié)核分枝桿菌從進(jìn)入宿主細(xì)胞,直至宿主發(fā)病的過(guò)程中,激發(fā)了宿主機(jī)體的強(qiáng)免疫反應(yīng),同時(shí)其通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)的平衡,使之更加適合于其在宿主體內(nèi)寄生,導(dǎo)致宿主發(fā)病,甚至導(dǎo)致宿主死亡。為了準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病,除了檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌所導(dǎo)致的明顯肺部病變特征外,另外主要還是靠實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)檢測(cè)宿主體內(nèi)是否存在結(jié)核分枝桿菌以及其所激發(fā)的免疫反應(yīng)特征,并最終確診宿主是否患了結(jié)核病及患病程度。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷目前除抗酸桿菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法外,應(yīng)用較多的是利用核酸探針雜交和PCR擴(kuò)增等技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性DNA序列進(jìn)行檢測(cè),利用抗原-抗體反應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行檢測(cè),EL ISPO T診斷技術(shù)、全血 IFNγ檢測(cè)方法和其他細(xì)胞因子檢測(cè)方法等[4],新的檢測(cè)結(jié)核的診斷方法和技術(shù)還在不斷的涌現(xiàn)[5],但仍然缺乏快速、準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷方法[6]。目前作為被檢目標(biāo)的結(jié)核菌特異性抗原主要有脂阿拉伯甘露糖抗 原[7]、38 kD[8]、ESA T6[9],CFP10,M PT64,PstsS1,Ag85B,rpoB,M r90等,但基于這些特異性抗原的診斷方法的靈敏度、特異性仍然不能夠達(dá)到理想的要求,結(jié)核病診斷方法和技術(shù)的敏感性和特異性均直接取決于目標(biāo)分子的特異性,目標(biāo)分子特異性的高低直接影響結(jié)核檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。篩選和鑒定新的特異性的目標(biāo)分子作為診斷結(jié)核病的標(biāo)靶仍是開發(fā)新的診斷技術(shù)的關(guān)鍵。

結(jié)核分枝桿菌Rv2352c基因是本課題組利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等方法篩選出來(lái)的特異性基因之一。目前對(duì) Rv2352c基因進(jìn)行的研究報(bào)道還很少。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 Rv2352c的原核表達(dá)質(zhì)粒。所用質(zhì)粒PET30 a(+)是一種融合型蛋白的表達(dá)載體,通過(guò)在編碼的外源蛋白的N端構(gòu)建6個(gè)組氨酸殘基,利用Ni-N TA樹脂可方便地將外源蛋白從菌體蛋白中純化出來(lái)。SDS-PA GE電泳分析發(fā)現(xiàn),在45 kD左右出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶且與目標(biāo)蛋白的分子量大小一致,即為Rv2352c蛋白。將目的蛋白純化后免疫新西蘭大白兔,能夠激發(fā)新西蘭大白兔產(chǎn)生高滴度的抗體反應(yīng),收集兔抗結(jié)核分枝桿菌Rv2352c抗血清,并通過(guò)親和層析法純化獲得對(duì)應(yīng)的多克隆抗體;對(duì)Rv2352c重組蛋白進(jìn)行免疫印記分析,結(jié)果顯示此重組蛋白不僅能夠與結(jié)核病人的血清發(fā)生免疫反應(yīng),同時(shí)也能夠與其兔抗血清發(fā)生免疫反應(yīng),這說(shuō)明Rv2352c蛋白既有較好的免疫反應(yīng)性也有很好的免疫原性。

本研究成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體p ET30a(+):Rv2352c,并獲得了純化的 Rv2352c重組蛋白,同時(shí)還獲得了該重組蛋白對(duì)應(yīng)的多克隆抗體,并證實(shí)Rv2352c蛋白既有較好的免疫反應(yīng)性也有很好的免疫原性。這為進(jìn)一步篩選結(jié)核病的診斷和防治的靶抗原奠定了基礎(chǔ)。

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