侯耀兵　康保珊　黃進勇

摘要：結(jié)合西瓜介紹植物中類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)、生物合成途徑中的酶及基因、合成調(diào)控研究進展．提出目前研究存在的問題，并展望未來的研究方向。

關(guān)鍵詞：西瓜；類胡蘿卜素；基因；表達；調(diào)控

類胡蘿卜素通常是指C40的碳氫化合物(胡蘿卜素)和它們的氧化衍生物(葉黃素)2類色素的總稱。它們在結(jié)構(gòu)上由8個異戊二烯單位縮合而成，典型的C類胡蘿卜索攜帶紫羅酮環(huán)。環(huán)上不同位置的氫原子可被羥基、羰基、環(huán)氧基取代。在植物中．類胡蘿卜素擔(dān)當(dāng)葉綠體光合作用的輔助色素并保護葉綠素免受強光破壞。同時也是合成植物激素ABA的前體。除八氫番茄紅素和六氫番茄紅素外．絕大多數(shù)類胡蘿卜素呈黃色、橙色或紅色。約有10％的類胡蘿卜素是維生素A的前體．是人和動物食物中重要的成分。研究表明．類胡蘿卜素在醫(yī)學(xué)保健方面有重要的作用。目前．對類胡蘿卜素的需求量很大．通過化學(xué)合成與微生物發(fā)酵等獲得的類胡蘿卜素已經(jīng)不能滿足市場的需要。近年對其生物合成途徑的研究取得了巨大的進展．關(guān)鍵基因先后得到分離．并初步實現(xiàn)通過基因工程來調(diào)控類胡蘿卜素的合成。

西瓜作為重要的世界性水果．在我國栽培面積近150萬hm2。西瓜有各種不同的瓤色，如黃色、橘黃色、粉紅色、紅色等，這是由于含有的類胡蘿卜素種類和量不同。瓤色是西瓜的重要性狀之一。其中類胡蘿卜素更是決定其營養(yǎng)與品質(zhì)的重要指標。提高或改變西瓜中類胡蘿h素組成和含量．改良其品質(zhì)已成為目前西瓜育種工作的重要課題。本文概述了類胡蘿卜素生物合成途徑中的酶和基因及表達調(diào)控方面的研究。尤其是在西瓜方面的研究進展。

1類胡蘿卜素的生物合成途徑及其相關(guān)酶的基因克隆

類胡蘿h生物合成主要是先合成前體物異戊烯焦磷酸(IPP)，LPP和其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)縮合形成檻牛兒基焦磷酸．再與2個IPP在櫳牛兒糖牛兒基焦磷酸合成酶(GGPs)催化下合成櫳牛兒糖牛兒基焦磷酸(GGPP)，GGPP是植物多種物質(zhì)生物合成的共同前體。然后2分子的GGPP由八氫番茄紅素合成酶(PSY)催化形成無色的八氫番茄紅素。后者在PDS和ZDS的作用下形成紅色的番茄紅素。番茄紅素經(jīng)LCYB和LCYE催化環(huán)化，形成2個B環(huán)的B-胡蘿卜素和a-胡蘿卜素(1個B和1個8環(huán))，這是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點。a-胡蘿卜素通過連續(xù)的羥基化反應(yīng)形成葉黃素。B-胡蘿卜素羥基化反應(yīng)形成玉米黃素。再經(jīng)玉米黃素環(huán)氧酶催化形成堇菜黃素。

1．1IPP異構(gòu)酶

Blanc和PicherskvH首先從Clarkia Brewer中克隆了IPP異構(gòu)酶(IPPI)的eDNA。IPPI催化IPP形成DMAPP。目前在辣椒、水仙、擬南芥、萵苣等植物中得到分離鑒定．在擬南芥中發(fā)現(xiàn)2個IPPI。在大腸桿菌中．IPPI的活性受類異戊二烯合成產(chǎn)物的限制。導(dǎo)入植物、藻類或真菌IPPI eDNA都能成倍提高類胡蘿卜素含量．推測IPPI也可能是植物類胡蘿h素合成的限制因素。

1．2櫳牛兒犍牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)

GGPS是萜類物質(zhì)合成的一個重要分支點酶。該酶基因已從白羽扇豆、長春花和自芥中得到分離．其eDNA長1．1—1．4 kb，編碼316-366個氨基酸。本組從西瓜中克隆得到508bp的GGPS eDNA片段，編碼169個氨基酸序列，Blast比對后發(fā)現(xiàn)，與其他植物GGPS氨基酸序列同源性在85％以上。

1．3八氫番茄紅素合成酶(PSY)

PSY是類胡蘿卜素合成途徑重要的限速酶．其基因早期是從番茄中獲得的?，F(xiàn)已從辣椒、擬南芥、玉米、黃水仙、甜瓜和白芥等植物中分離出PSY。在番茄、煙草、玉米和水稻等植物中有2個PSY基因．即PSY1與PSY2。PSYl和PSY2分別催化番茄果實和葉組織中八氫番茄紅素的合成。目前已鑒別了PSY基因家族的3個成員，PSY-A，PSY-B與PSY-C。其中PSY-A和PSY-C有很高的同源性．PSY-C和甜瓜PSY的同源性高達96％。和番茄PSYl也有非常高的同一性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明。西瓜的PSY-A和胡蘿卜PSY親緣關(guān)系近．而西瓜PSY-A和PSY-B的同源性只有54％．轉(zhuǎn)錄行為也明顯不同。目前本組已從西瓜中克隆到-748 bp的PSY eDNA片段，GenBank登錄號：(D0494214)，它編碼247個氨基酸．經(jīng)Blast比對后發(fā)現(xiàn)．與其他植物PSY氨基酸序列同源性在90％以上．但和BANG分離得到的PSY同源性很低。

1．4八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)

PDS催化八氫番茄紅素向￡－胡蘿卜素轉(zhuǎn)化。Chamovitz等從大豆和番茄上分離到PDS。已報道從辣椒、擬南芥、玉米、黃水仙、野生煙草和白芥等植物中也分離到PDS．其eDNA長1．9～2．3 kb，編碼566-582個氨基酸。本組已經(jīng)從成熟西瓜果實中克隆得到這個基因的eDNA片段．GenBank登錄號：EFl59942。

1．5類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISo)

Isaacson和Park等19-101分別從番茄和擬南芥中分離鑒定了類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)．并確認由八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為番茄紅素是PDS、ZDS和CRTISO 3個酶共同作用的結(jié)果．它們的催化產(chǎn)物分別是9，9－二順式－￡－胡蘿卜素、7，9，7，9"-四順式一番茄紅素和全反式番茄。在植物和藍細菌中．八氫番茄紅素是經(jīng)這3個酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)槿词椒鸭t素．而在細菌中是由單個酶(cRTI)催化。Bangt分離得到西瓜CRTISO cDNA全長，包括l 998 bp開放閱讀框。本組克隆得到484 bp的CRTISO cDNA片段(GenBank登錄號：FJ788510)，編碼161個氨基酸．經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)與其他植物CRTISO氨基酸序列同源性在80％以上。

1．6胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)

ZDS催化z－胡蘿卜素脫氫生成鏈孢霉素．繼而進一步脫氫生成番茄紅素。目前ZDS也已從辣椒、擬南芥和黃水仙中分離出來，其eDNA長1．8-2．1 kb。編碼558-574個氨基酸。BangDt]報道了西瓜ZDS eDNA全長(2 062 bp)，包括1 758 bp開放閱讀框。ZDS和PDS基因大小相近、編碼的氨基酸同源性為29％-31％。本組從西瓜中克隆到422 bD的ZDS eDNA片段(GenBank登錄號：GQl40241)，編碼140個氨基酸，Blast比對后表明．與其他植物ZDS氨基酸序列同源性在80％以上。

2植物類胡蘿卜素合成途徑調(diào)控

2．1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

高等植物的類胡蘿卜素的生物合成受生長和個體發(fā)育的調(diào)控。不同發(fā)育階段的花和果實所積累的類胡蘿卜素的種類及量不同。用番茄PSY、PDS、LCYB和LCYE的eDNA作探

針，檢測其果實發(fā)育過程中這些基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，在果實進入番茄紅素積累的轉(zhuǎn)色期后．PSY基因的mRNA增加10-20倍，PDS基因的mRNA則增加近3倍．而LCYB和LCYE基因的mRNA卻明顯下降直到消失舊．番茄果實中番茄紅素積累顯然是由于轉(zhuǎn)色期后合成番茄紅素上游的PSY和PDS基因表達增強以及轉(zhuǎn)化番茄紅素生成胡蘿卜素的LCYB和LCYE基因表達減弱的結(jié)果。Zhu等舊用克隆到的黃花龍膽類胡蘿卜素合成基因作探針檢測花瓣發(fā)育過程中的mRNA變化，結(jié)果表明PSY、PDS、ZDS、LCYB、BCH和ZEP基因的mRNA量逐漸增加．而LCYE基因的mRNA量逐漸減少。Ban利用RT-PCR方法研究西瓜成熟果實基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，PSY-A在不同瓤色西瓜中的表達沒有明顯的差異，在子房、花瓣和葉片中都有表達。PSY-B在所有瓤色西瓜中都沒有檢測到表達．在子房、葉片和根組織中卻有表達。PDS、ZDS在所有瓤色中均有表達。CRTISO除了在深黃色西瓜中沒有檢測到表達外．在其他瓤色中均有表達。研究表明，PSY-A、PSY-B、CRTISO的調(diào)控可能在轉(zhuǎn)錄水平上。發(fā)育過程對類胡蘿卜素生物合成的調(diào)控是在基因轉(zhuǎn)錄水平上。是通過調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性來控制類胡蘿卜素代謝和積累的。已證實番茄、金盞草和黃花龍膽花中類胡蘿卜素的積累也是在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控的。

2．2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

在植物類胡蘿卜素生物合成過程中．轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也非常重要，在水仙有色體中，游離型的PSY和PDS均沒有生理活性，而與膜結(jié)合后，其生理活性便迅速被激活。Welseh等研究表明．在白芥幼苗的白化體內(nèi)．PSY以無活性狀態(tài)定位于原片層體(prolameIlarbody)上，而光照條件下，PSY與類囊體膜相結(jié)合，其活性和酶量也迅速增加。類胡蘿卜素終產(chǎn)物反饋抑制也是類胡蘿卜素合成過程中的一種調(diào)控方式．Camoisi等舊研究發(fā)現(xiàn)．向日葵中八氫番茄紅素的積累會導(dǎo)致PSY基因表達量降低。在西瓜上目前還未見轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的報道。

2．3調(diào)節(jié)基因調(diào)控

光信號傳導(dǎo)基因?qū)χ参镱惡}卜素生物合成和積累也有一定的調(diào)控作用。Liu等利用RNAi技術(shù)對光信號傳導(dǎo)基因LeHY5和LeCOPlLIKE進行調(diào)控．LeHY5和LeCOPILIKE分別為番茄果實色素正調(diào)控和負調(diào)控因子．當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株中的LeHY5基因表達受到抑制時．葉片和未成熟果實變成淡綠色，葉綠素含量下降了24％～31％。相反．當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株中的LeCOPILIKE基因表達受到抑制時．葉片和未成熟果實變成深綠色。這一結(jié)果說明．利用RNAi技術(shù)對光信號傳導(dǎo)途徑的組分基因進行調(diào)控．可以大幅度改變番茄果實的色素積累和營養(yǎng)品質(zhì)。

3展望

目前．植物類胡蘿卜素生物合成途徑中大部分的基因均已被分離和鑒定．通過類胡蘿卜素基因工程獲得“金色大米”和“金油菜”極大地增強人們開展其基因工程的信心。但是．對于內(nèi)源胡蘿卜素合成的相關(guān)基因在不同植物中如何表達及調(diào)控知之有限，這使得在調(diào)控植物類胡蘿卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理論基礎(chǔ)而帶有盲目性。此外．通過基因工程改變類胡蘿卜素的合成途徑可能會干擾植物其他萜類化合物。如植物激素GA等的合成．影響植株的正常生長，因而更增加了植物類胡蘿卜素基因工程研究的難度。

本組克隆到多個西瓜類胡蘿卜素生物合成酶的基因．并初步分析了各基因在不同瓤色品種西瓜果實生長發(fā)育階段的表達，為下一步轉(zhuǎn)基因操作做好準備。目前．克隆西瓜類胡蘿卜素代謝途徑全部酶基因．研究基因在不同品種西瓜中的表達調(diào)控以及酶活性，將對提高或改變西瓜中類胡蘿卜素組成和含量，豐富西瓜果實顏色，改良西瓜品質(zhì)都有非常重要的意義。