王改芳

摘要對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)原理、組成以及酵母雙雜交在生命科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，以期為酵母雙雜交系統(tǒng)在生命科學(xué)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞酵母雙雜交系統(tǒng)；生命科學(xué)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2009）04-0259-01

1酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

酵母雙雜交系統(tǒng)（two-hybrid system）也叫相互作用陷阱（interaction trap），是1989年由Stanley和Song等提出并初步建立的，并于20世紀(jì)90年代得到發(fā)展。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4，在結(jié)構(gòu)上是組件式（modular）的，往往由2個(gè)或2個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（acti-vation domain，DNA-AD）。這2個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的二者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

2酵母雙雜交系統(tǒng)的組成

一個(gè)酵母雙雜交系統(tǒng)包括3個(gè)部分：帶有1個(gè)或多個(gè)攝制報(bào)告基因的宿主菌株；與GAL4-BD融合表達(dá)蛋白，被表達(dá)的蛋白稱為旅館誘餌蛋白（bait）；GAL4-AD融合表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱為靶蛋白（prey）。為了防止釀酒酵母內(nèi)源性的GAL4的影響，人們將該基因誤敲除掉，發(fā)展成雙雜交宿主菌株。常用的缺陷型酵母菌株有SFY526和HF7c，帶有特定的報(bào)告基因lacZ 、his3和leu2等，但喪失表達(dá)內(nèi)源GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子的能力。所用的質(zhì)粒載體為能在大腸埃細(xì)菌和釀酒酵母中進(jìn)行復(fù)制的穿梭質(zhì)粒。第1種質(zhì)粒載體是pGBT9，又叫DNA-BD載體。誘餌蛋白基因是按照正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)被克隆在這個(gè)載體的多克隆位點(diǎn)上，于是就在誘餌蛋白GAL4-BD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白Ⅰ。第2種質(zhì)粒載體是pGAD424，又叫AD質(zhì)粒載體，是用來構(gòu)建欲篩選靶蛋白的cDNA文庫的專用載體?？寺〉腸DNA片段是按照正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入到載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)內(nèi)，因此，cDNA編碼的蛋白質(zhì)便與GAL4-AD產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)Ⅱ。這2種雜種蛋白質(zhì)都能在酵母細(xì)胞中得到高水平的表達(dá)，而且在核定位序列（nuclear localization sequence）的作用下進(jìn)入到酵母的細(xì)胞核內(nèi)。pGBT9中的核定位序列是GAL4DNA結(jié)合域序列中間的一部分。而在pGAD424載體中，核定位序列是SV40的T抗原序列，被克隆在ADH1啟動(dòng)子和GAL4激發(fā)結(jié)構(gòu)域序列之間。SV40的核定位序列使核內(nèi)的蛋白量可以滿足檢測(cè)的靈敏度需要。

3酵母雙雜交的應(yīng)用

3.1利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能

酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平臺(tái)，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。為了研究2個(gè)蛋白之間相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，找到影響或抑制2個(gè)蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和基因修飾證明了alpha-synuclein的1~65個(gè)氨基酸殘基和Synphilin-1的349~555個(gè)氨基酸殘基之間是相互作用的位點(diǎn)。研究它們之間的相互作用位點(diǎn)有利于基因治療藥物的開發(fā)。

3.2利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，研究抗原和抗體之間的相互作用，但是它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應(yīng)中，抗體單鏈的3個(gè)可變區(qū)A4、G4、H3與抗原之間作用有強(qiáng)弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術(shù)，將DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的3個(gè)可變區(qū)的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉(zhuǎn)化到改造后的酵母菌株中，并檢測(cè)報(bào)告基因在克隆的菌落中的表達(dá)活性，從而在活細(xì)胞的水平上檢測(cè)抗原和抗體的免疫反應(yīng)。

3.3利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）和拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。

3.4利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map）

眾多的蛋白質(zhì)在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的?；蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，以所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)，如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。

4參考文獻(xiàn)

[1] 張樹民，陳英碚.酵母雙雜交體系的新發(fā)展[J].國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊(cè)，1999，22（5）：225-227.

[2] FIELDS S，SONG O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature，1989，20（340）：245-251.

[3] WONG C，NAUMOVSKI L.Method to screen for relevant yeast two-hybird-derived clones by coimmunoprecipitation and colocalization of epitope-tagged fragments-application to Bd-XL[J].Anal Biochem，1997，252（1）：33-41.

[4] BRENT R，PTASHNE M.A eukargotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of aprokaanyotic repreesor[J].Cell，1985，43（3）：729-736.

[5] MA J，PTASHNE M.Converting a eukanyotic transcriptional inhibitor into an activator[J].Cell，1988，55（3）：443-448.

[6] YANG M，F(xiàn)IELDS S.Protein-peptide intevactions andyzed with the yeast two-hybird system[J].Nucleic Acids Res，1995（23）：1152-1156.

[7] WATSON MA，BUCKHOLZ R，WEINER MP.Vectors encoding alte-rnative antibiotic vesistance for use in the yeast two-hybird system[J].Biotechniques，1996，21（2）：255-259.

[8] BEMIS LT，GESKE F J，STRANGE R.Use of the yeast two-hybird system for identifying the cascade of protein interachions resulting in apoptotic cell death[J].Methods Cell Biol，1995（46）：139-151.

[9] JAMES P，HALLADAY J，GRAIG E A.Genomic libraries and a host strain desingned for highly efficient two-hybird selection in yeast[J].Genetics，1996（144）：1425-1436.