李永梅

[摘要] 目的: 建立了同時(shí)檢測(cè)藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考的高效液相色譜檢測(cè)法。方法:采用Hypersil-ODS2 (4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶磷酸二氫銨(0.1 mol/L)=10∶11∶29,pH=3.50,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,流速為1 ml/min。結(jié)果:實(shí)現(xiàn)了氟尼康中鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考的較好分離;鹽酸多西環(huán)素在6.25～200.00 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,r=0.999 4,平均回收率為99.29%,RSD為0.51%(n=3);氟苯尼考在6.25～250.00 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,r=0.999 9,平均回收率為98.87%,RSD為0.32%(n=3)。結(jié)論:該方法快速簡(jiǎn)便,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可作為藥物氟尼康質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜;鹽酸多西環(huán)素;氟苯尼考;氟尼康

[中圖分類(lèi)號(hào)]R927.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]1674-4721(2009)07(a)-068-03

鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考為我國(guó)獸藥標(biāo)準(zhǔn)《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(第一冊(cè))》中批準(zhǔn)的內(nèi)服藥。鹽酸多西環(huán)素(doxycycline hydrochloride)為四環(huán)素類(lèi)廣譜抗生素,主要用于革蘭陽(yáng)性和陰性菌感染[1]。氟苯尼考(florfenicol)為氯霉素類(lèi)廣譜抗生素,主要用于治療魚(yú)、豬、牛及家禽類(lèi)的細(xì)菌性感染[2]。我國(guó)及歐盟、日本等國(guó)對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)含量有嚴(yán)格要求,因此,對(duì)于有治療作用的氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考含量的測(cè)定,需有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)定量測(cè)定。藥典中包含兩種物質(zhì)各自的檢測(cè)方法,而對(duì)于兩種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)沒(méi)有相應(yīng)的規(guī)定。因此,建立鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)的方法,在藥物生產(chǎn)和藥品檢驗(yàn)過(guò)程中極為重要。鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的檢測(cè)方法多采用薄層檢測(cè)法、氣相色譜法、液相色譜法[3-6]等。本論文采用較為簡(jiǎn)單的溶劑作為流動(dòng)相,建立了同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)的高效液相色譜法,方法簡(jiǎn)便、精確、檢測(cè)靈敏度高,分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),可以作為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器高效液相色譜儀(LC-10ATvp日本島津公司)配SPD-10Avp紫外檢測(cè)器;TOP色譜工作站;針筒式微孔濾膜過(guò)濾器0.45 μm(天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠); AL-204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);PHS-3CPH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2 試劑鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、氟尼康(河北遠(yuǎn)征藥業(yè)提供);甲醇(色譜純,天津康科德公司);乙腈(色譜純,天津康科德公司);磷酸二氫銨(天津市博迪化工有限公司);磷酸(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);三次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱:大連依利特公司,Hypersil-ODS2 (4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶磷酸二氫銨(0.1 mol/L)=10∶11∶29,pH=3.50,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,流速為1 ml/min,柱溫:30℃,進(jìn)樣量10 μl,靈敏度0.01 AUFS。

1.3 儲(chǔ)備溶液配制

分別精密稱(chēng)取鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg,置于50 ml棕色容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為儲(chǔ)備液,4℃冰箱冷藏待用。

1.4 供試液的制備

用研缽將氟尼康研碎后,稱(chēng)取50 mg,置于50 ml棕色容量瓶中,用流動(dòng)相溶解后并定容,作為供試液,4℃冰箱冷藏待用。

2 結(jié)果

2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水的不同比例的流動(dòng)相對(duì)兩者的分離效果,鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的出峰時(shí)間相同,不能夠達(dá)到分離,因此將乙腈、甲醇以一定比例混合加入磷酸二氫銨的鹽溶液,對(duì)3種溶液比例進(jìn)行了調(diào)節(jié),實(shí)驗(yàn)中隨著乙腈和甲醇比例的增加,兩種物質(zhì)出峰時(shí)間同時(shí)前移,分離效果漸差;當(dāng)乙腈比例逐漸增大時(shí),氟苯尼考的色譜峰型漸差;當(dāng)甲醇比例逐漸增大時(shí),鹽酸多西環(huán)素的色譜峰型托尾嚴(yán)重;磷酸二氫銨鹽溶液比例增加時(shí),兩種物質(zhì)出峰時(shí)間向后推移,且分離效果逐漸變優(yōu),但鹽溶液加入過(guò)多時(shí),二者保留時(shí)間較長(zhǎng),且分離不佳。此外,pH值的確定也會(huì)同時(shí)影響二者的分離效果,適當(dāng)減小pH值,可以達(dá)到較優(yōu)的分離效果。實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)得到乙腈∶甲醇∶磷酸氫二銨溶液=10∶11∶29,pH=3.50,為最佳比例。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

鹽酸多西環(huán)素的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為269 nm,氟苯尼考的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為220 nm,鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考結(jié)構(gòu)式中均含有苯環(huán),因此為了使得兩者都能更好的檢測(cè),選定檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

藥品氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精確移取儲(chǔ)備液適量,并將儲(chǔ)備液置于容量瓶中,用流動(dòng)相定容,由此逐級(jí)稀釋得一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用孔徑0.45 μm的有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)。在1.2項(xiàng)條件下,進(jìn)樣分析,以其色譜峰面積(Y)作為縱坐標(biāo),以分析樣品濃度(C)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

鹽酸多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:Y=-10 611+3.533 2×106C,r=0.999 4,在6.25~200.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好;氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:Y=-292.97+1.99×105C,r=0.999 9,在6.25~250.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.4 回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)量0.080 、0.100、0.120 g的鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考置于10 ml容量瓶,加入適當(dāng)流動(dòng)相定容,并定量稀釋成約80、100、120 μg/ml的溶液(每個(gè)濃度n=3),超聲溶解,用孔徑0.45 μm的有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)。精密吸取上述溶液10 μl,注入液相色譜進(jìn)行分析,用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算回收率。

2.5精密度試驗(yàn)

將鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考儲(chǔ)備液稀釋10倍,分別量取兩種溶液各25 ml,均勻混合后,注入液相色譜進(jìn)行分析,連續(xù)進(jìn)樣7次,計(jì)算該方法的精密度,得到鹽酸多西環(huán)素的精密度為RSD=0.87%;氟苯尼考的精密度為RSD=0.72%。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品溶液在自然光照射的條件下,在0、2、4、6、10、12、24 h時(shí)測(cè)定其主成分峰面積,鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考二者峰面積基本不變,RSD分別為0.94%和0.83%,結(jié)果表明供試品氟尼康溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3 討論

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn),對(duì)檢測(cè)方法中使用的溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相等分析條件進(jìn)行了多次摸索,找到了一種在同一色譜條件下,實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)的方法。本方法簡(jiǎn)便、快捷,結(jié)果可靠準(zhǔn)確,可用做藥物氟尼康的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法,靈敏度高,顯示出較好的分離效果。

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(收稿日期:2009-05-22)