摘要：根據(jù)半夏三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用PCR技術(shù)克隆PtNAC48基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在半夏根、塊莖、葉柄、葉片4個(gè)組織部位和15% PEG 4000模擬干旱脅迫處理下不同時(shí)間段的基因表達(dá)變化，以探究干旱脅迫下PtNAC48的功能與作用，為后續(xù)研究該基因響應(yīng)半夏干旱脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，成功克隆PtNAC48基因，基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 086 bp，編碼361個(gè)氨基酸，含有NAC轉(zhuǎn)錄因子典型NAM保守結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位在細(xì)胞核中，PtNAC48是親水性蛋白，無信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)，存在糖基化和磷酸化位點(diǎn)。序列比對(duì)和進(jìn)化分析表明，PtNAC48和其他物種已報(bào)道的NAC蛋白有相似的保守序列，與玉米ZmNAC071親緣關(guān)系最近。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PtNAC48基因在半夏的葉柄中表達(dá)量最高，在根中最低，模擬干旱處理下該基因表達(dá)量隨處理時(shí)間逐漸升高，脅迫24 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后呈下降趨勢(shì)；轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)證明PtNAC48蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。PtNAC48基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)該基因在響應(yīng)半夏干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：半夏；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；生物信息學(xué)；干旱脅迫；表達(dá)分析；轉(zhuǎn)錄激活

中圖分類號(hào)：S188；S567.23+9.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0218-07

收稿日期：2024-01-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：82274048）；安徽省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（編號(hào)：2022AH010029）；2023年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：S202310373057）。

作者簡(jiǎn)介：蘇傳棟（1998—），男，安徽淮南人，碩士研究生，從事藥用植物研究。E-mail：scd18555969851@163.com。

通信作者：伯 晨，博士，講師，從事玉米和藥用植物方面的研究，E-mail：boc2625@163.com；薛建平，博士，教授，從事藥用植物生物技術(shù)、藥用植物資源學(xué)等方面的研究，E-mail：xuejp@163.com。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)受到高溫、低溫、干旱、高鹽等非生物因素的影響，受環(huán)境脅迫，大量脅迫響應(yīng)基因被誘導(dǎo)表達(dá)［1］。水分是植物賴以生存的條件之一，缺水時(shí)植物為了抵御干旱環(huán)境的影響進(jìn)化出多種機(jī)制以適應(yīng)外界環(huán)境變化，其中就包括基因表達(dá)［2-3］。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是一類擁有抵御生物脅迫與非生物脅迫作用的調(diào)控蛋白，能與真核生物基因啟動(dòng)子的順式作用元件特異性結(jié)合，從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用［4］。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員已經(jīng)在不同植物中發(fā)現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)錄因子并確定了它們的功能［5］。

NAC（NAM、ATF1/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種植物中，并且在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫中起到重要作用［6-7］。其N末端有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域分為A～E 5個(gè)子結(jié)構(gòu)域，其中 A～D組成名為NAM的結(jié)構(gòu)域，D、E與DNA結(jié)合有關(guān)，C末端有高度可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域［8-9］。子結(jié)構(gòu)域C、D高度保守，起到與DNA結(jié)合的作用，子結(jié)構(gòu)域B和E可與C端的結(jié)構(gòu)域一起調(diào)控NAC蛋白功能的多樣性［10］。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)多種逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。在棉花（Gossypium）中，GhNAC2-A06通過去除過量活性氧（ROS）抵御干旱脅迫，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理下該基因沉默的植株生長(zhǎng)狀態(tài)較對(duì)照植株更差，說明GhNAC2-A06在棉花干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用；在水稻（Oryza sativa）中，研究發(fā)現(xiàn)ONAC022受干旱、高鹽、ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，將其過表達(dá)到水稻中，結(jié)果表明該基因的過表達(dá)可通過ABA介導(dǎo)途徑提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱能力；在甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）中，DINAC1被證明增強(qiáng)了下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因甘菊對(duì)干旱、低溫和高鹽的耐受性；在小黑麥（×Triticosecale Wittmack）中研究發(fā)現(xiàn)，抗旱基因TwNAC01在過表達(dá)擬南芥中能通過增加根長(zhǎng)和減少體內(nèi)ROS含量來提高植物的耐受性；此外，研究發(fā)現(xiàn)在干旱、ABA、鹽脅迫下，蕎麥（Fagopyrum esculentum）中的FtNAC31基因上調(diào)表達(dá)，通過ABA依賴途徑增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性和抗旱性［11-15］。以上研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控植物抗旱性方面發(fā)揮著重要的作用。

半夏（Pinellia ternata）為天南星科植物，其藥用器官塊莖含有生物堿、有機(jī)酸、黃酮類等多種活性物質(zhì)，有燥濕化痰、止吐、抗炎等多種藥理作用，同時(shí)也是治療新冠病毒的中藥材之一［16-19］。半夏喜陰，懼光怕熱，最適生長(zhǎng)溫度15～25 ℃，在土壤缺水的環(huán)境下半夏地上部分出現(xiàn)枯萎死亡的現(xiàn)象稱為“倒苗”，“倒苗”現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了半夏的品質(zhì)和產(chǎn)量［20-21］。因此半夏抗旱性的研究對(duì)于提高產(chǎn)量具有重要意義。本研究基于半夏三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得半夏抗旱相關(guān)基因PtNAC48并克隆出其CDS全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)、表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄活性分析，為后續(xù)深入研究其抗旱生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試半夏品種為淮北師范大學(xué)試驗(yàn)田（117.93°E，33.55°N）收取的宿半夏，于2022年10月采樣后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取大小、形態(tài)相似的半夏塊莖種于花盆中，置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（16 h光照/8 h 黑暗），半夏長(zhǎng)至3葉期時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的半夏幼苗分別取根、塊莖、葉柄、葉片放入液氮中速凍，放置在-80 ℃冰箱保存。另選取一些長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉期半夏幼苗，用15%PEG-4000溶液對(duì)其噴灑，模擬干旱脅迫。在0、4、12、24、48、72 h分別取整株半夏作為待測(cè)樣品，取樣之后迅速放入液氮中速凍，放置在-80 ℃冰箱保存，待測(cè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

供試的Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自abm生物公司；瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Blunt-simple載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；Taq SYBR Green qPCR Premix（Universal）購(gòu)自江蘇百時(shí)美生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 利用Trizol總RNA提取試劑盒提取半夏不同組織部位和模擬干旱脅迫不同處理時(shí)間的總RNA，使用Maestrogen超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，放置-20 ℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)（克隆基因以干旱脅迫處理0 h下的cDNA為擴(kuò)增模板）。

1.2.2 半夏PtNAC48基因的克隆 根據(jù)半夏3代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的PtNAC48基因CDS全長(zhǎng)序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物為PtNAC48-F（ATGGGTCAAGTGTCACTTCCAC）、PtNAC48-R（TCAATGAACAGTCCTCCAGTCATC）。25 μL PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix-Dye，上下游引物（10 mol/L）各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的片段，連接到blunt載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆菌株，并將其送至通用生物（安徽）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 PtNAC48生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)址見表1；利用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；使用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 PtNAC48表達(dá)模式分析 以不同部位和模擬干旱脅迫不同處理時(shí)間（0、4、12、24、48、72 h）的半夏cDNA為模板，Pt18SrRNA為內(nèi)參基因（Pt18SqRT-F：CGCATATAAATAAACGGAGGAA；Pt18SqRT-R：GACGCTTCTACAGACTACA），檢測(cè)PtNAC48（PtNAC48qRT-F：GTGGCAAGAAGAGGACTTGC；PtNAC48qRT-R：CAGAATGGGCTACCTCCAAA）的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)總體系為10 μL，Taq SYBR Green qPCR Premix 5 μL，上下游引物（10 mol/L）各0.4 μL，cDNA模板1 μL，dd H2O 3.2 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，獲得的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析［22］。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn) 將PtNAC48基因通過同源重組的方法構(gòu)建重組載體pGBKT7-PtNAC48，在無菌操作臺(tái)中將陽(yáng)性質(zhì)粒（1 μg pGBKT7-53+1 μg pGADT7-T）、陰性質(zhì)粒（1 μg pGBKT7空載）、重組載體分別與100 ℃加熱10 min的carrier DNA一起分別轉(zhuǎn)入50 μL Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中輕彈混勻，加入250 μL LiAC（醋酸鋰），輕彈混勻，30 ℃水浴30 min，42 ℃水浴15 min，冰上穩(wěn)定2 min，5 000 r/min 離心40 s之后棄上清，取400 μL ddH2O重懸再次離心棄上清，取100～130 μL ddH2O重懸，取50 μL涂板（陰性對(duì)照與重組質(zhì)粒涂在SD/-Trp培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照涂在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基），30 ℃倒置培養(yǎng)48～96 h。待菌斑長(zhǎng)出后，用槍頭挑取完整菌斑用ddH2O重懸混勻，按10-1等比例稀釋重懸液，點(diǎn)斑于SD/-Trp與SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal培養(yǎng)平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱正置6 h，然后倒置培養(yǎng)48 h，觀察酵母生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtNAC48基因克隆

以半夏cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到長(zhǎng)度為1 086 bp的目的條帶（圖1），膠回收純化后與blunt載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中，挑選陽(yáng)性單克隆菌落送測(cè)，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的CDS序列一致。

2.2 PtNAC48生物信息學(xué)分析

使用ExPASy-ProtParam在線軟件對(duì)PtNAC48氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，PtNAC48所編碼的蛋白共有361個(gè)氨基酸；蛋白分子式為C1 802H2 765N493O543S20；理論相對(duì)分子質(zhì)量為 40.67 ku，等電點(diǎn)為5.29；脂肪族指數(shù)為67.45，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.84gt;40；蛋白親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，疏水性最大值與最小值分別為1.900與 -3.111，屬于不穩(wěn)定親水性蛋白（圖2）。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其定位于細(xì)胞核內(nèi)，跨膜域預(yù)測(cè)與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3和圖4）顯示PtNAC48無明顯跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析表明（圖5），PtNAC48蛋白N端具有NAM的保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白含有Cl03558超家族（屬于NAM蛋白家族）的特征蛋白序列，由此推測(cè)半夏PtNAC48蛋白屬于Cl03558超家族成員。

利用在線軟件SOPMA對(duì)PtNAC48蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖6），發(fā)現(xiàn)其主要結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲（63.71%），還有α-螺旋（16.62%）與延伸鏈（14.96%）以及少量的β-折疊（4.71%），由于無規(guī)則卷曲所占比例較大，其結(jié)構(gòu)可能比較復(fù)雜。運(yùn)用SWISS-MODEL，預(yù)測(cè)PtNAC48蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖7）， 以A0A843VP19_COLES蛋白AlphaFold DB

為模型，其QMEAN值為0.57，預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白以無規(guī)則卷曲為主，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，可能存在糖基化位點(diǎn)（數(shù)值大于0.5）。蛋白質(zhì)磷酸化廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控［23］。通過對(duì)PtNAC48基因編碼的蛋白使用Nethos 3.1在線軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)（圖9），結(jié)果顯示PtNAC48有絲氨酸21個(gè)、蘇氨酸16個(gè)、酪氨酸5個(gè)，絲氨酸的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨界值0.5。

2.3 PtNAC48多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將PtNAC48蛋白序列與玉米、黑小麥、鷹嘴豆（Cicer arietinum）等物種中已明確生物學(xué)功能的NAC蛋白序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示半夏

PtNAC48與玉米ZmNAC071的親緣關(guān)系最近（圖10），根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種之間存在的NAC轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的一致性較高，而非保守結(jié)構(gòu)域的差異較大（圖11）。

2.4 PtNAC48組織表達(dá)模式與干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式的分析

使用qRT-PCR檢測(cè)PtNAC48在半夏根、葉柄、葉片、塊莖部位中的表達(dá)量。結(jié)果顯示其在葉柄中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最少，表明該基因在半夏不同組織部位的表達(dá)具有差異性。對(duì)半夏使用15% PEG 4000進(jìn)行模擬干旱脅迫，以不同處理時(shí)間的半夏為材料，Pt18S rRNA為內(nèi)參基因，對(duì)PtNAC48基因進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)PtNAC48表達(dá)量在干旱處理0～24 h呈上升趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最大，之后表達(dá)量逐漸降低（圖12）。

2.5 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)

將陽(yáng)性對(duì)照、pGBKT7-PtNAC48M2（對(duì)于該基因全長(zhǎng)鑒定后發(fā)現(xiàn)其具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，需找到其無活性區(qū)段進(jìn)行酵母雙雜交篩選互作蛋白，對(duì)該基因進(jìn)行分段鑒定，該基因共分成4段，命名為M1、M2、M3、M4，M2段包含N端與該基因domain并驗(yàn)證無轉(zhuǎn)錄自激活活性，可用于后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)篩選互作蛋白）、陰性對(duì)照點(diǎn)斑于SD/-Trp與SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal固體培養(yǎng)板上，結(jié)果（圖13）顯示在SD/-Trp的平板上，對(duì)照組和試驗(yàn)組均生長(zhǎng)良好；在SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal平板上，只有陽(yáng)性對(duì)照可以正常生長(zhǎng)，pGBKT7-PtNAC48M2與陰性對(duì)照不能正常生長(zhǎng)，結(jié)果表明PtNAC48不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

3 討論與結(jié)論

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，提高植物的抗旱能力是解決干旱影響較為有效的途徑。

隨著研究技術(shù)及設(shè)備的不斷發(fā)展，許多與干旱脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的基因已經(jīng)在許多植物中被發(fā)現(xiàn)并已解析出其功能和信號(hào)通路，使得通過遺傳和分子層面操作提高植物的抗逆能力得以實(shí)現(xiàn)［24-25］。轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是提高植物抗逆性的關(guān)鍵因素。NAC轉(zhuǎn)錄因子在許多植物物種中均有報(bào)道，包括擬南芥、水稻、玉米、大豆和土豆［26-30］。作為植物體內(nèi)的一類重要調(diào)控蛋白，NAC在干旱、高溫等非生物脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。然而，與其他植物相比半夏NAC蛋白的生物學(xué)功能報(bào)道以及作用機(jī)制的研究十分罕有，嚴(yán)重制約著對(duì)這一類型基因的發(fā)現(xiàn)和利用。因此，分析并克隆半夏NAC家族基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，有利于解析半夏響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制。

對(duì)本研究克隆得到的PtNAC48基因進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因CDS序列長(zhǎng) 1 086 bp，可編碼361個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量40.67 ku，等電點(diǎn)為5.29，屬于親水性蛋白。該基因編碼的蛋白具有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的NAM結(jié)構(gòu)域，是典型的NAC家族成員，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該基因定位在細(xì)胞核，無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)，在預(yù)測(cè)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比較大，這與關(guān)于毛紅椿、大蒜等NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果相同，與已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相符［31-32］。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)PtNAC48可能存在糖基化位點(diǎn)（數(shù)值大于0.5），磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示其含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)且以絲氨酸最多，說明該蛋白可能通過調(diào)控相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)發(fā)揮功能，也證明了在真核生物中發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)主要在絲氨酸上［33］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PtNAC48與玉米的ZmNAC071親緣關(guān)系較近。ZmNAC071基因過表達(dá)負(fù)調(diào)控ROS清除系統(tǒng)、降低脯氨酸的含量和膜的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA和滲透脅迫的敏感性［34］。推測(cè)它們可能在逆境脅迫方面具有相似的作用，為進(jìn)一步研究PtNAC48基因干旱脅迫相關(guān)功能提供了參考。

組織表達(dá)模式和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析顯示，PtNAC48基因在半夏幼苗的根、葉柄、葉片、塊莖中均有表達(dá)，但葉柄中含量最高，葉片與塊莖次之，根中含量最少，推測(cè)PtNAC48基因可通過葉柄和葉片調(diào)控半夏生長(zhǎng)發(fā)育過程與抗旱功能。對(duì)半夏模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，在脅迫后24 h內(nèi)PtNAC48基因的表達(dá)量逐步升高，4～12 h增長(zhǎng)率最大，在24 h達(dá)到最大值，之后明顯降低。有研究表明在其他植物中NAC轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫之后基因的表達(dá)量會(huì)迅速升高并達(dá)到最大值［35-36］，推測(cè)PtNAC48基因可迅速響應(yīng)干旱脅迫信號(hào)并參與到半夏抵御干旱脅迫的通路中。以上研究說明該基因能積極響應(yīng)半夏干旱脅迫，據(jù)此初步推測(cè)PtNAC48基因在半夏響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。在研究轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，判斷其在酵母細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，是后續(xù)進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和酵母文庫(kù)互作蛋白篩選的關(guān)鍵步驟。半夏PtNAC48屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)結(jié)果表明，PtNAC48蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，推測(cè)其可能與互作蛋白結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)從而參與半夏對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

目前對(duì)半夏中NAC基因的研究幾乎罕有，本研究從半夏中發(fā)現(xiàn)并克隆出干旱脅迫相關(guān)基因PtNAC48，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)模式分析，保守序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出與其他已報(bào)道的NAC轉(zhuǎn)錄因子具有相似性，基因表達(dá)分析結(jié)果表明PtNAC48基因?qū)Ω珊得{迫作出了積極響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)驗(yàn)證了該蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。為進(jìn)一步挖掘PtNAC48基因在半夏中的抗旱分子機(jī)制，增強(qiáng)半夏在干旱環(huán)境中的生長(zhǎng)能力，筆者計(jì)劃對(duì)PtNAC48進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，以闡明該基因在干旱脅迫響應(yīng)中的機(jī)制。

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