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        半夏PtNAC48基因克隆與表達(dá)分析

        2025-04-16 00:00:00蘇傳棟紀(jì)明芳王振朱艷芳薛濤伯晨薛建平
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2025年4期
        關(guān)鍵詞:表達(dá)分析基因克隆干旱脅迫

        摘要:根據(jù)半夏三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用PCR技術(shù)克隆PtNAC48基因,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在半夏根、塊莖、葉柄、葉片4個(gè)組織部位和15% PEG 4000模擬干旱脅迫處理下不同時(shí)間段的基因表達(dá)變化,以探究干旱脅迫下PtNAC48的功能與作用,為后續(xù)研究該基因響應(yīng)半夏干旱脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明,成功克隆PtNAC48基因,基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 086 bp,編碼361個(gè)氨基酸,含有NAC轉(zhuǎn)錄因子典型NAM保守結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位在細(xì)胞核中,PtNAC48是親水性蛋白,無信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu),存在糖基化和磷酸化位點(diǎn)。序列比對(duì)和進(jìn)化分析表明,PtNAC48和其他物種已報(bào)道的NAC蛋白有相似的保守序列,與玉米ZmNAC071親緣關(guān)系最近。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,PtNAC48基因在半夏的葉柄中表達(dá)量最高,在根中最低,模擬干旱處理下該基因表達(dá)量隨處理時(shí)間逐漸升高,脅迫24 h時(shí)表達(dá)量最高,隨后呈下降趨勢(shì);轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)證明PtNAC48蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。PtNAC48基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),推測(cè)該基因在響應(yīng)半夏干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用。

        關(guān)鍵詞:半夏;NAC轉(zhuǎn)錄因子;基因克??;生物信息學(xué);干旱脅迫;表達(dá)分析;轉(zhuǎn)錄激活

        中圖分類號(hào):S188;S567.23+9.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號(hào):1002-1302(2025)04-0218-07

        收稿日期:2024-01-18

        基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào):82274048);安徽省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(編號(hào):2022AH010029);2023年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):S202310373057)。

        作者簡(jiǎn)介:蘇傳棟(1998—),男,安徽淮南人,碩士研究生,從事藥用植物研究。E-mail:scd18555969851@163.com。

        通信作者:伯 晨,博士,講師,從事玉米和藥用植物方面的研究,E-mail:boc2625@163.com;薛建平,博士,教授,從事藥用植物生物技術(shù)、藥用植物資源學(xué)等方面的研究,E-mail:xuejp@163.com。

        植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)受到高溫、低溫、干旱、高鹽等非生物因素的影響,受環(huán)境脅迫,大量脅迫響應(yīng)基因被誘導(dǎo)表達(dá)[1]。水分是植物賴以生存的條件之一,缺水時(shí)植物為了抵御干旱環(huán)境的影響進(jìn)化出多種機(jī)制以適應(yīng)外界環(huán)境變化,其中就包括基因表達(dá)[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)是一類擁有抵御生物脅迫與非生物脅迫作用的調(diào)控蛋白,能與真核生物基因啟動(dòng)子的順式作用元件特異性結(jié)合,從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用[4]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,研究人員已經(jīng)在不同植物中發(fā)現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)錄因子并確定了它們的功能[5]。

        NAC(NAM、ATF1/2和CUC2)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于各種植物中,并且在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫中起到重要作用[6-7]。其N末端有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域分為A~E 5個(gè)子結(jié)構(gòu)域,其中 A~D組成名為NAM的結(jié)構(gòu)域,D、E與DNA結(jié)合有關(guān),C末端有高度可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域[8-9]。子結(jié)構(gòu)域C、D高度保守,起到與DNA結(jié)合的作用,子結(jié)構(gòu)域B和E可與C端的結(jié)構(gòu)域一起調(diào)控NAC蛋白功能的多樣性[10]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)多種逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。在棉花(Gossypium)中,GhNAC2-A06通過去除過量活性氧(ROS)抵御干旱脅迫,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理下該基因沉默的植株生長(zhǎng)狀態(tài)較對(duì)照植株更差,說明GhNAC2-A06在棉花干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用;在水稻(Oryza sativa)中,研究發(fā)現(xiàn)ONAC022受干旱、高鹽、ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),將其過表達(dá)到水稻中,結(jié)果表明該基因的過表達(dá)可通過ABA介導(dǎo)途徑提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱能力;在甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中,DINAC1被證明增強(qiáng)了下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因甘菊對(duì)干旱、低溫和高鹽的耐受性;在小黑麥(×Triticosecale Wittmack)中研究發(fā)現(xiàn),抗旱基因TwNAC01在過表達(dá)擬南芥中能通過增加根長(zhǎng)和減少體內(nèi)ROS含量來提高植物的耐受性;此外,研究發(fā)現(xiàn)在干旱、ABA、鹽脅迫下,蕎麥(Fagopyrum esculentum)中的FtNAC31基因上調(diào)表達(dá),通過ABA依賴途徑增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性和抗旱性[11-15]。以上研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控植物抗旱性方面發(fā)揮著重要的作用。

        半夏(Pinellia ternata)為天南星科植物,其藥用器官塊莖含有生物堿、有機(jī)酸、黃酮類等多種活性物質(zhì),有燥濕化痰、止吐、抗炎等多種藥理作用,同時(shí)也是治療新冠病毒的中藥材之一[16-19]。半夏喜陰,懼光怕熱,最適生長(zhǎng)溫度15~25 ℃,在土壤缺水的環(huán)境下半夏地上部分出現(xiàn)枯萎死亡的現(xiàn)象稱為“倒苗”,“倒苗”現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了半夏的品質(zhì)和產(chǎn)量[20-21]。因此半夏抗旱性的研究對(duì)于提高產(chǎn)量具有重要意義。本研究基于半夏三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得半夏抗旱相關(guān)基因PtNAC48并克隆出其CDS全長(zhǎng)序列,對(duì)其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)、表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄活性分析,為后續(xù)深入研究其抗旱生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試半夏品種為淮北師范大學(xué)試驗(yàn)田(117.93°E,33.55°N)收取的宿半夏,于2022年10月采樣后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取大小、形態(tài)相似的半夏塊莖種于花盆中,置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(16 h光照/8 h 黑暗),半夏長(zhǎng)至3葉期時(shí),選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的半夏幼苗分別取根、塊莖、葉柄、葉片放入液氮中速凍,放置在-80 ℃冰箱保存。另選取一些長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉期半夏幼苗,用15%PEG-4000溶液對(duì)其噴灑,模擬干旱脅迫。在0、4、12、24、48、72 h分別取整株半夏作為待測(cè)樣品,取樣之后迅速放入液氮中速凍,放置在-80 ℃冰箱保存,待測(cè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

        供試的Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自abm生物公司;瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Blunt-simple載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;Taq SYBR Green qPCR Premix(Universal)購(gòu)自江蘇百時(shí)美生物科技有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 利用Trizol總RNA提取試劑盒提取半夏不同組織部位和模擬干旱脅迫不同處理時(shí)間的總RNA,使用Maestrogen超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,放置-20 ℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)(克隆基因以干旱脅迫處理0 h下的cDNA為擴(kuò)增模板)。

        1.2.2 半夏PtNAC48基因的克隆 根據(jù)半夏3代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的PtNAC48基因CDS全長(zhǎng)序列為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,引物為PtNAC48-F(ATGGGTCAAGTGTCACTTCCAC)、PtNAC48-R(TCAATGAACAGTCCTCCAGTCATC)。25 μL PCR反應(yīng)體系為:12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix-Dye,上下游引物(10 mol/L)各1 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,62 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒回收目的片段,連接到blunt載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性單克隆菌株,并將其送至通用生物(安徽)股份有限公司測(cè)序。

        1.2.3 PtNAC48生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)址見表1;利用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì);使用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

        1.2.4 PtNAC48表達(dá)模式分析 以不同部位和模擬干旱脅迫不同處理時(shí)間(0、4、12、24、48、72 h)的半夏cDNA為模板,Pt18SrRNA為內(nèi)參基因(Pt18SqRT-F:CGCATATAAATAAACGGAGGAA;Pt18SqRT-R:GACGCTTCTACAGACTACA),檢測(cè)PtNAC48(PtNAC48qRT-F:GTGGCAAGAAGAGGACTTGC;PtNAC48qRT-R:CAGAATGGGCTACCTCCAAA)的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)總體系為10 μL,Taq SYBR Green qPCR Premix 5 μL,上下游引物(10 mol/L)各0.4 μL,cDNA模板1 μL,dd H2O 3.2 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,運(yùn)行40個(gè)循環(huán),進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù),獲得的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[22]。

        1.2.5 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn) 將PtNAC48基因通過同源重組的方法構(gòu)建重組載體pGBKT7-PtNAC48,在無菌操作臺(tái)中將陽(yáng)性質(zhì)粒(1 μg pGBKT7-53+1 μg pGADT7-T)、陰性質(zhì)粒(1 μg pGBKT7空載)、重組載體分別與100 ℃加熱10 min的carrier DNA一起分別轉(zhuǎn)入50 μL Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中輕彈混勻,加入250 μL LiAC(醋酸鋰),輕彈混勻,30 ℃水浴30 min,42 ℃水浴15 min,冰上穩(wěn)定2 min,5 000 r/min 離心40 s之后棄上清,取400 μL ddH2O重懸再次離心棄上清,取100~130 μL ddH2O重懸,取50 μL涂板(陰性對(duì)照與重組質(zhì)粒涂在SD/-Trp培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照涂在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基),30 ℃倒置培養(yǎng)48~96 h。待菌斑長(zhǎng)出后,用槍頭挑取完整菌斑用ddH2O重懸混勻,按10-1等比例稀釋重懸液,點(diǎn)斑于SD/-Trp與SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal培養(yǎng)平板上,置于30 ℃培養(yǎng)箱正置6 h,然后倒置培養(yǎng)48 h,觀察酵母生長(zhǎng)狀態(tài)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PtNAC48基因克隆

        以半夏cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆得到長(zhǎng)度為1 086 bp的目的條帶(圖1),膠回收純化后與blunt載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中,挑選陽(yáng)性單克隆菌落送測(cè),測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的CDS序列一致。

        2.2 PtNAC48生物信息學(xué)分析

        使用ExPASy-ProtParam在線軟件對(duì)PtNAC48氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,PtNAC48所編碼的蛋白共有361個(gè)氨基酸;蛋白分子式為C1 802H2 765N493O543S20;理論相對(duì)分子質(zhì)量為 40.67 ku,等電點(diǎn)為5.29;脂肪族指數(shù)為67.45,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.84gt;40;蛋白親疏水性分析發(fā)現(xiàn),疏水性最大值與最小值分別為1.900與 -3.111,屬于不穩(wěn)定親水性蛋白(圖2)。

        亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,其定位于細(xì)胞核內(nèi),跨膜域預(yù)測(cè)與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3和圖4)顯示PtNAC48無明顯跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽,屬于非分泌蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析表明(圖5),PtNAC48蛋白N端具有NAM的保守結(jié)構(gòu)域,該蛋白含有Cl03558超家族(屬于NAM蛋白家族)的特征蛋白序列,由此推測(cè)半夏PtNAC48蛋白屬于Cl03558超家族成員。

        利用在線軟件SOPMA對(duì)PtNAC48蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖6),發(fā)現(xiàn)其主要結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲(63.71%),還有α-螺旋(16.62%)與延伸鏈(14.96%)以及少量的β-折疊(4.71%),由于無規(guī)則卷曲所占比例較大,其結(jié)構(gòu)可能比較復(fù)雜。運(yùn)用SWISS-MODEL,預(yù)測(cè)PtNAC48蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7), 以A0A843VP19_COLES蛋白AlphaFold DB

        為模型,其QMEAN值為0.57,預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白以無規(guī)則卷曲為主,結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖8)顯示,可能存在糖基化位點(diǎn)(數(shù)值大于0.5)。蛋白質(zhì)磷酸化廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[23]。通過對(duì)PtNAC48基因編碼的蛋白使用Nethos 3.1在線軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)(圖9),結(jié)果顯示PtNAC48有絲氨酸21個(gè)、蘇氨酸16個(gè)、酪氨酸5個(gè),絲氨酸的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨界值0.5。

        2.3 PtNAC48多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

        將PtNAC48蛋白序列與玉米、黑小麥、鷹嘴豆(Cicer arietinum)等物種中已明確生物學(xué)功能的NAC蛋白序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì),使用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示半夏

        PtNAC48與玉米ZmNAC071的親緣關(guān)系最近(圖10),根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種之間存在的NAC轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的一致性較高,而非保守結(jié)構(gòu)域的差異較大(圖11)。

        2.4 PtNAC48組織表達(dá)模式與干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式的分析

        使用qRT-PCR檢測(cè)PtNAC48在半夏根、葉柄、葉片、塊莖部位中的表達(dá)量。結(jié)果顯示其在葉柄中表達(dá)量最高,根中表達(dá)量最少,表明該基因在半夏不同組織部位的表達(dá)具有差異性。對(duì)半夏使用15% PEG 4000進(jìn)行模擬干旱脅迫,以不同處理時(shí)間的半夏為材料,Pt18S rRNA為內(nèi)參基因,對(duì)PtNAC48基因進(jìn)行qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)PtNAC48表達(dá)量在干旱處理0~24 h呈上升趨勢(shì),在24 h達(dá)到最大,之后表達(dá)量逐漸降低(圖12)。

        2.5 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)

        將陽(yáng)性對(duì)照、pGBKT7-PtNAC48M2(對(duì)于該基因全長(zhǎng)鑒定后發(fā)現(xiàn)其具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,需找到其無活性區(qū)段進(jìn)行酵母雙雜交篩選互作蛋白,對(duì)該基因進(jìn)行分段鑒定,該基因共分成4段,命名為M1、M2、M3、M4,M2段包含N端與該基因domain并驗(yàn)證無轉(zhuǎn)錄自激活活性,可用于后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)篩選互作蛋白)、陰性對(duì)照點(diǎn)斑于SD/-Trp與SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal固體培養(yǎng)板上,結(jié)果(圖13)顯示在SD/-Trp的平板上,對(duì)照組和試驗(yàn)組均生長(zhǎng)良好;在SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal平板上,只有陽(yáng)性對(duì)照可以正常生長(zhǎng),pGBKT7-PtNAC48M2與陰性對(duì)照不能正常生長(zhǎng),結(jié)果表明PtNAC48不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

        3 討論與結(jié)論

        干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一,提高植物的抗旱能力是解決干旱影響較為有效的途徑。

        隨著研究技術(shù)及設(shè)備的不斷發(fā)展,許多與干旱脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的基因已經(jīng)在許多植物中被發(fā)現(xiàn)并已解析出其功能和信號(hào)通路,使得通過遺傳和分子層面操作提高植物的抗逆能力得以實(shí)現(xiàn)[24-25]。轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子,是提高植物抗逆性的關(guān)鍵因素。NAC轉(zhuǎn)錄因子在許多植物物種中均有報(bào)道,包括擬南芥、水稻、玉米、大豆和土豆[26-30]。作為植物體內(nèi)的一類重要調(diào)控蛋白,NAC在干旱、高溫等非生物脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。然而,與其他植物相比半夏NAC蛋白的生物學(xué)功能報(bào)道以及作用機(jī)制的研究十分罕有,嚴(yán)重制約著對(duì)這一類型基因的發(fā)現(xiàn)和利用。因此,分析并克隆半夏NAC家族基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析,有利于解析半夏響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制。

        對(duì)本研究克隆得到的PtNAC48基因進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該基因CDS序列長(zhǎng) 1 086 bp,可編碼361個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子量40.67 ku,等電點(diǎn)為5.29,屬于親水性蛋白。該基因編碼的蛋白具有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的NAM結(jié)構(gòu)域,是典型的NAC家族成員,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該基因定位在細(xì)胞核,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu),在預(yù)測(cè)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比較大,這與關(guān)于毛紅椿、大蒜等NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果相同,與已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相符[31-32]。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)PtNAC48可能存在糖基化位點(diǎn)(數(shù)值大于0.5),磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示其含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)且以絲氨酸最多,說明該蛋白可能通過調(diào)控相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)發(fā)揮功能,也證明了在真核生物中發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)主要在絲氨酸上[33]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PtNAC48與玉米的ZmNAC071親緣關(guān)系較近。ZmNAC071基因過表達(dá)負(fù)調(diào)控ROS清除系統(tǒng)、降低脯氨酸的含量和膜的穩(wěn)定性,從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA和滲透脅迫的敏感性[34]。推測(cè)它們可能在逆境脅迫方面具有相似的作用,為進(jìn)一步研究PtNAC48基因干旱脅迫相關(guān)功能提供了參考。

        組織表達(dá)模式和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析顯示,PtNAC48基因在半夏幼苗的根、葉柄、葉片、塊莖中均有表達(dá),但葉柄中含量最高,葉片與塊莖次之,根中含量最少,推測(cè)PtNAC48基因可通過葉柄和葉片調(diào)控半夏生長(zhǎng)發(fā)育過程與抗旱功能。對(duì)半夏模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn),在脅迫后24 h內(nèi)PtNAC48基因的表達(dá)量逐步升高,4~12 h增長(zhǎng)率最大,在24 h達(dá)到最大值,之后明顯降低。有研究表明在其他植物中NAC轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫之后基因的表達(dá)量會(huì)迅速升高并達(dá)到最大值[35-36],推測(cè)PtNAC48基因可迅速響應(yīng)干旱脅迫信號(hào)并參與到半夏抵御干旱脅迫的通路中。以上研究說明該基因能積極響應(yīng)半夏干旱脅迫,據(jù)此初步推測(cè)PtNAC48基因在半夏響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。在研究轉(zhuǎn)錄因子時(shí),判斷其在酵母細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,是后續(xù)進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和酵母文庫(kù)互作蛋白篩選的關(guān)鍵步驟。半夏PtNAC48屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族,轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)結(jié)果表明,PtNAC48蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,推測(cè)其可能與互作蛋白結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)從而參與半夏對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

        目前對(duì)半夏中NAC基因的研究幾乎罕有,本研究從半夏中發(fā)現(xiàn)并克隆出干旱脅迫相關(guān)基因PtNAC48,屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族,對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)模式分析,保守序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出與其他已報(bào)道的NAC轉(zhuǎn)錄因子具有相似性,基因表達(dá)分析結(jié)果表明PtNAC48基因?qū)Ω珊得{迫作出了積極響應(yīng),轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)驗(yàn)證了該蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。為進(jìn)一步挖掘PtNAC48基因在半夏中的抗旱分子機(jī)制,增強(qiáng)半夏在干旱環(huán)境中的生長(zhǎng)能力,筆者計(jì)劃對(duì)PtNAC48進(jìn)行基因功能驗(yàn)證,以闡明該基因在干旱脅迫響應(yīng)中的機(jī)制。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Huang Q J,Wang Y,Li B,et al. TaNAC29,a NAC transcription factor from wheat,enhances salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. BMC Plant Biology,2015,15:268.

        [2]張 雨,蘇 旭,劉玉萍,等. 沙鞭PvDREB基因克隆與表達(dá)特異性分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2023,43(2):202-210.

        [3]Mijiti M,Wang Y C,Wang L Q,et al. Tamarix hispida NAC transcription factor ThNAC4 confers salt and drought stress tolerance to transgenic Tamarix and Arabidopsis[J]. Plants,2022,11(19):2647.

        [4]張 麗,張 庭,譚登峰,等. 玉米ZmNAC99基因的克隆及干旱誘導(dǎo)表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2017,37(4):629-635.

        [5]Mohanta T K,Yadav D,Khan A,et al. Genomics,molecular and evolutionary perspective of NAC transcription factors[J]. PLoS One,2020,15(4):e0231425.

        [6]Zhao S P,Jiang T,Zhang Y,et al. Identification of the NAC transcription factors and their function in ABA and salinity response in Nelumbo nucifera[J]. International Journal of Molecular Sciences,2022,23(20):12394.

        [7]Nuruzzaman M,Sharoni A M,Kikuchi S. Roles of NAC transcription factors in the regulation of biotic and abiotic stress responses in plants[J]. Frontiers in Microbiology,2013,4:248.

        [8]Yang S D,Seo P J,Yoon H K,et al. The Arabidopsis NAC transcription factor VNI2 integrates abscisic acid signals into leaf senescence via the COR/RD genes[J]. The Plant Cell,2011,23(6):2155-2168.

        [9]Wang Q,Guo C,Li Z Y,et al. Potato NAC transcription factor StNAC053 enhances salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. International Journal of Molecular Sciences,2021,22(5):2568.

        [10]Ooka H,Satoh K,Doi K,et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Research,2003,10(6):239-247.

        [11]Saimi G,Wang Z Y,Liusui Y H,et al. The functions of an NAC transcription factor,GhNAC2-A06,in cotton response to drought stress[J]. Plants,2023,12(21):3755.

        [12]Hong Y B,Zhang H J,Huang L,et al. Overexpression of a stress-responsive NAC transcription factor gene ONAC022 improves drought and salt tolerance in rice[J]. Frontiers in Plant Science,2016,7:4.

        [13]Yang Y F,Zhu K,Wu J,et al. Identification and characterization of a novel NAC-like gene in chrysanthemum (Dendranthema lavandulifolium)[J]. Plant Cell Reports,2016,35(8):1783-1798.

        [14]Wang M,Ren L T,Wei X Y,et al. NAC transcription factor TwNAC01 positively regulates drought stress responses in Arabidopsis and Triticale[J]. Frontiers in Plant Science,2022,13:877016.

        [15]Zhao J L,Wu Q,Wu H L,et al. FtNAC31,a Tartary buckwheat NAC transcription factor,enhances salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2022,191:20-33.

        [16]耿曉桐,劉 琦,花嬌嬌,等. 半夏化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 山西化工,2023,43(9):53-54,61.

        [17]郭連安,莫讓瑜,譚 均,等. 高溫脅迫下半夏葉片的轉(zhuǎn)錄組分析[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,57(3):84-94.

        [18]趙 麗,徐加兵,陳曉蘭,等. 半夏地上、地下部分活性成分分析及鎮(zhèn)咳作用比較[J]. 中國(guó)藥房,2023,34(11):1337-1342.

        [19]孫元鵬,劉于思,程 正,等. 用于治療新冠肺炎的中藥材半夏道地性保護(hù)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,59(13):199-204.

        [20]黃文靜,孫曉春,李 鉑,等. 干旱脅迫誘導(dǎo)半夏倒苗的細(xì)胞程序性死亡研究[J]. 中國(guó)中藥雜志,2019,44(10):2020-2025.

        [21]馬聰吉,張智慧,王 麗,等. 不同溫度對(duì)半夏倒苗的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技,2021(6):11-13.

        [22]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

        [23]McCahill I W,Hazen S P. Regulation of cell wall thickening by a medley of mechanisms[J]. Trends Plant Sci,2019,24(9):853-866.

        [24]李 健,李 曦,農(nóng)艷豐.芒果bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2023,51(21):29-36.

        [25]紀(jì)藝紅,索梅芹,邵子瑩,等. 馬鈴薯StNAC6基因克隆及干旱脅迫表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2024,52(11):51-60.

        [26]Jensen M K,Kjaersgaard T,Nielsen M M,et al. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family:structure-function relationships and determinants of ANAC019 stress signalling[J]. Biochemical Journal,2010,426(2):183-196.

        [27]Nuruzzaman M,Manimekalai R,Sharoni A M,et al. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J]. Gene,2010,465(1/2):30-44.

        [28]Wang G R,Yuan Z,Zhang P Y,et al. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in maize under drought stress and rewatering[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants,2020,26(4):705-717.

        [29]Le D T,Nishiyama R,Watanabe Y,et al. Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress[J]. DNA Research,2011,18(4):263-276.

        [30]Singh A K,Sharma V,Pal A K,et al. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato (Solanum tuberosum L.)[J]. DNA Research,2013,20(4):403-423.

        [31]鐘秋蔚,馬際凱,賈 婷,等. 毛紅椿TcNAC2基因克隆及在干旱脅迫下的表達(dá)分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2023,45(5):1051-1060.

        [32]閆藝薇,田 潔. 大蒜NAC基因家族的鑒定與低溫表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2023,25(4):67-76.

        [33]Zeng Z,Li F,Huang R Y,et al. Phosphoproteome analysis reveals an extensive phosphorylation of proteins associated with bast fiber growth in ramie[J]. BMC Plant Biology,2021,21(1):473.

        [34]He L,Bian J,Xu J Y,et al. Novel maize NAC transcriptional repressor ZmNAC071 confers enhanced sensitivity to ABA and osmotic stress by downregulating stress-responsive genes in transgenic Arabidopsis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(32):8905-8918.

        [35]Yu M X,Liu J L,Du B S,et al. NAC transcription factor PwNAC11 activates ERD1 by interaction with ABF3 and DREB2A to enhance drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. International Journal of Molecular Sciences,2021,22(13):6952.

        [36]Mao H D,Yu L J,Han R,et al. ZmNAC55,a maize stress-responsive NAC transcription factor,confers drought resistance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2016,105:55-66.

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