摘要：詩琳通木蘭（Magnolia sirindhorniae Noot. amp; Chalermglin）作為木蘭科園林綠化優(yōu)良新品種，具有極高的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。bHLH轉(zhuǎn)錄因子為植物第二大轉(zhuǎn)錄因子基因家族，在植物抗逆方面發(fā)揮重要作用。本研究基于鹽堿脅迫下詩琳通木蘭轉(zhuǎn)錄組，鑒定詩琳通木蘭bHLH基因家族成員，利用生物信息學(xué)分析詩琳通木蘭bHLH轉(zhuǎn)錄因子的蛋白理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和保守基序等特征，結(jié)合鹽堿脅迫中詩琳通木蘭葉和根的基因表達分析，篩選出與鹽堿脅迫響應(yīng)相關(guān)的bHLH。結(jié)果表明，詩琳通木蘭鑒定出72個bHLH保守結(jié)構(gòu)域的成員，蛋白大小在72～736 aa之間，均為親水蛋白，MsbHLH蛋白亞細胞定位預(yù)測顯示，大部分bHLH存在于細胞核中。將系統(tǒng)發(fā)育進化樹分成23個亞家族，詩琳通木蘭分布在17個亞組中，組內(nèi)基因結(jié)構(gòu)相似，都具有相同的motif1和motif2。詩琳通木蘭bHLH基因表達分析結(jié)果顯示，差異基因MsbHLH13、MsbHLH14表達量發(fā)生顯著變化，可能與詩琳通木蘭的耐鹽堿能力相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步深入研究MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽堿脅迫的分子響應(yīng)機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：詩琳通木蘭；bHLH基因家族；鹽堿脅迫；基因表達

中圖分類號：S188；S718.43" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0141-13

收稿日期：2024-03-09

基金項目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（編號：2023KJCX002）。

作者簡介：謝 微（1999—），女，湖南衡陽人，碩士，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：1269389348@qq.com。

通信作者：鄧小梅，博士，教授，主要從事林木遺傳育種研究工作。E-mail：dxmei2006@scau.edu.cn。

詩琳通木蘭（Magnolia sirindhorniae Noot. amp; Chalermglin）為木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬植物，于1999年在泰國中部沼澤地被發(fā)現(xiàn)，2003年泰國公主詩琳通訪華時贈予中國［1-2］。作為常綠大喬木，詩琳通木蘭樹冠寬廣、花精巧秀麗，具有較高的園林綠化功能；木材可供建筑、家具、室內(nèi)裝修等用材；樹皮、葉片和花均可提取香精油，經(jīng)濟價值極高；耐澇性強，有一定耐熱耐旱能力，具有較強的適應(yīng)性，生態(tài)效益極高且應(yīng)用前景十分廣闊［3-5］。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子包含堿性區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）2個結(jié)構(gòu)高度保守區(qū)域，是僅次于MYB家族的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于動物、植物及微生物等真核生物中。bHLH轉(zhuǎn)錄因子最早報道參與了玉米（Zea mays L.）花青素的合成［6］，隨后在擬南芥［Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.］、水稻（Oryza sativa L.）、楊樹（Populus L.）等模式植物中被發(fā)現(xiàn)報道［7-9］。研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、次生代謝中起著至關(guān)重要的作用［10-11］，同時也參與調(diào)控植物響應(yīng)干旱、鹽堿、低溫高溫和缺乏營養(yǎng)元素等多種非生物脅迫［12-17］。鹽堿脅迫是一種危害非常嚴重的非生物脅迫，持續(xù)高鹽堿土壤環(huán)境會造成土壤滲透勢降低和pH值升高，致使植物生長發(fā)育活動停滯，嚴重時植物體內(nèi)會積累過多金屬離子而死亡［18］。研究證明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物鹽堿抗性密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtbHLH122和AtMYC2轉(zhuǎn)錄因子通過負調(diào)節(jié)下游基因AtNHX1和AtNHX6使擬南芥突變體更具耐鹽性［19］；玉米ZmbHLH55通過直接調(diào)節(jié)GDP-甘露糖途徑基因，增加抗壞血酸生物的合成來提高耐鹽性［20］；西瓜中鑒定的96個bHLH基因家族成員中有14個基因受到鹽脅迫時顯著表達［21］；將云南紅梨PybHLH基因轉(zhuǎn)到煙草中進行過表達，轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性有一定提高［22］；在毛竹鑒定的153個bHLH基因家族成員中，有15個PebHLH基因表達量發(fā)生顯著變化應(yīng)對鹽脅迫［23］；水培鹽脅迫和盆栽鹽脅迫中，CpbHLH36、CpbHLH68、CpbHLH146被驗證參與青錢柳耐鹽基因調(diào)控［24］。目前，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆方向的研究內(nèi)容豐富，但詩琳通木蘭bHLH轉(zhuǎn)錄因子抗逆方向研究，特別是鹽堿脅迫方面鮮有報道。本研究基于詩琳通木蘭轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用生物信息學(xué)篩選出bHLH家族基因，進行分類鑒定和理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域分析，與擬南芥bHLH家族基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析詩琳通木蘭在鹽堿脅迫下的bHLH基因表達模式，預(yù)測bHLH蛋白三維結(jié)構(gòu)，為進一步研究詩琳通木蘭bHLH基因鹽堿脅迫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及脅迫處理

本研究以生長至50 cm的詩琳通木蘭組培盆栽苗為試驗材料，試驗前對盆栽苗進行常規(guī)水肥管理，試驗時對照組澆灌1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液，脅迫組澆灌由1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液配制的Na+濃度為250 mmol/L的鹽處理液，其中鹽處理液的中性鹽NaCl和堿性鹽NaHCO3摩爾比為1 ∶1，每個處理5株，重復(fù)3次。采集脅迫30 d的葉片和根部樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。本試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院進行，試驗時間為2022年7—8月。

1.2 詩琳通木蘭bHLH基因家族成員鑒定、理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在TAIR網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的基因序列及蛋白序列，在Interpro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）蛋白家族數(shù)據(jù)庫下載bHLH（PF00010）隱馬爾科夫模型，基于擬南芥基因基蛋白序列和PF00010模型，運用本地BLAST和HMMER 3.0軟件對詩琳通木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行BLASTp檢測（閾值：E值lt;10-5），獲得詩琳通木蘭中含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，利用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）剔除不具有bHLH結(jié)構(gòu)域和bHLH結(jié)構(gòu)域不完整的假陽性序列，最終篩選出確定的詩琳通木蘭bHLH轉(zhuǎn)錄因子。

使用在線軟件ExPASy的ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）計算獲得詩琳通木蘭bHLH蛋白的基本理化性質(zhì)，包含氨基酸殘基數(shù)、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂溶指數(shù)、親水性平均值等基本理化性質(zhì)；利用在線網(wǎng)站Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測詩琳通木蘭bHLH基因家族成員的亞細胞定位情況；運用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.3 詩琳通木蘭bHLH基因家族保守基序、保守結(jié)構(gòu)域與多重序列對比

利用在線軟件MEME分析詩琳通木蘭bHLH基因家族成員蛋白序列的motif，搜索數(shù)量設(shè)置為5，其他參數(shù)為默認值，并使用TBtools軟件將篩選后的蛋白保守基序進行可視化。將最終確認的蛋白序列上傳至NCBI搜索保守結(jié)構(gòu)域，下載hitdate文件，利用TBtools中的gene structure view對hitdate結(jié)果文件進行可視化。運用DNAMAN 6.0軟件對MsbHLH氨基酸序列進行多序列比對，用WebLogo 在線工具（https：//weblogo.berkeley.edu/）分析MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域氨基酸基序。

1.4 詩琳通木蘭bHLH基因家族系統(tǒng)進化分析

基于擬南芥bHLH家族蛋白序列，使用MEGA 11.0構(gòu)建擬南芥和詩琳通木蘭bHLH系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用鄰接法（neighbor-joining method），bootstrap值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)默認值，再使用在線軟件iTOL（https：//itol.embl.de/）對系統(tǒng)發(fā)育進化樹美化處理。

1.5 詩琳通木蘭bHLH基因在不同脅迫處理下的表達分析

通過對轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)的分析，計算基因表達水平并歸一化為FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）值，利用Tbtools繪制詩琳通木蘭bHLH基因鹽堿脅迫30 d時表達模式熱圖。

1.6 詩琳通木蘭bHLH蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)轉(zhuǎn)錄表達分析，對顯著響應(yīng)鹽堿脅迫的MsbHLH蛋白序列與PDB（https：//saves.mbi.ucla.edu/）在線數(shù)據(jù)庫進行PSI-blast同源比對，搜索得到MsbHLH最佳匹配的蛋白三維結(jié)構(gòu)模板，再以此模板運用 Swiss-model 在線工具（https：//swissmodel.expasy.org/）以同源建模的方式構(gòu)建MsbHLH蛋白三維結(jié)構(gòu)模型，篩選序列一致度在20%的蛋白序列三維結(jié)構(gòu)作為預(yù)測模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 詩琳通木蘭bHLH基因家族成員的鑒定、理化性質(zhì)及定位分析

經(jīng)過本地BLAST和 HMMER 3.0初步篩選，MEME剔除無結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)域不完整的序列后，共獲取72個MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員，將其重新編號為MsbHLH1～MsbHLH72（表1）。

使用Expasy在線軟件對MsbHLH蛋白理化性質(zhì)的分析結(jié)果表明，蛋白長度最大的是MsbHLH59，達到736 aa，最短的是MsbHLH72（72 aa）；蛋白分子量最大值和最小值分別為78 982.95 u和10 446.69 u，平均值為40 382.7 u。理論等電點在4.11～9.79之間。70%的MsbHLH蛋白等電點小于7，偏酸性，30%蛋白偏堿性；所有蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40；蛋白脂溶指數(shù)在56.35～100.75之間，大于等于60的蛋白高達68個；親水性均值均為負值，MsbHLH蛋白表現(xiàn)出較強的親水性，均為親水蛋白。

通過亞細胞定位預(yù)測（表2）發(fā)現(xiàn)，共有67個MsbHLH基因（93.05%）定位在細胞核內(nèi)，而MsbHLH8和MsbHLH26定位在葉綠體中，MsbHLH45、MsbHLH68定位在細胞質(zhì)中，MsbHLH29定位在細胞外。由蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可以得出，72個MsbHLH的蛋白均具有α-螺旋、延伸、β-折疊、無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出無規(guī)則卷曲數(shù)＞α-螺旋數(shù)≥延伸鏈數(shù)＞β-折疊數(shù)的特點（表3）。

2.2 詩琳通木蘭bHLH系統(tǒng)發(fā)育和分類分析

為進一步研究bHLH基因家族的進化關(guān)系，運用MEGA 11.0軟件對鑒定得到的72個詩琳通木蘭MsbHLH蛋白序列與158個擬南芥AtbHLH蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹分類情況（圖1），全部bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為23個亞家族，72個詩琳通木蘭bHLH聚類在17個亞家族上，G6、G7、G12、G13、G14和G21亞家族上無詩琳通木蘭bHLH成員，進化樹其余亞家族上包含了詩琳通木蘭和擬南芥bHLH；其中，G15組、G23組成員最少，均只有1個成員；G1組中成員最多，有13個MsbHLH成員。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，分布在相同亞家族內(nèi)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能具有相同的功能， 在詩琳通木蘭響應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮著相似作用， 可以

通過試驗進一步驗證。

2.3 詩琳通木蘭bHLH保守結(jié)構(gòu)域、motif分析和蛋白序列對比

運用MEME軟件對詩琳通木蘭bHLH基因蛋白基序（motif）進行預(yù)測，共鑒定出5個motif（motif1～motif5），motif長度為21～50個氨基酸（表4）。72個詩琳通木蘭bHLH蛋白中均有motif1和motif2，長度為29 aa和21 aa，且在所有MsbHLH中緊密相鄰，motif1包含1個堿性區(qū)域和1個螺旋區(qū)域，motif2包含1個環(huán)狀區(qū)域和另外1個螺旋區(qū)域，2個基序共同構(gòu)成bHLH結(jié)構(gòu)域（圖2）。同屬于一個亞族的bHLH具有種類和數(shù)目的motif，也存在些許差異，如G4、G15、G18、G19、G20、G23亞族中每個MsbHLH均只具有motif1和motif2，但其他亞族的MsbHLH蛋白中不僅有2個motif，也有3個motif， 類別也不一樣（圖3和圖4）。

通過DNAMAN軟件對72個bHLH蛋白進行序列比對（圖2），并用WebLogo在線軟件獲取詩琳通木蘭bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域序列標簽（圖2），MsbHLH蛋白保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列中有21個氨基酸殘基較為保守（sequence identity＞50%）， 7個氨基酸殘基高度保守（sequence identity＞90%），堿基區(qū)位于N端，α螺旋2區(qū)位于C端，分別由9、19個氨基酸殘基組成，堿基區(qū)有高度保守的R6-E9-R8-R9（Arg6-Glu9-Arg8-Arg9）4個位點，2個螺旋區(qū)有L19-P24-L51（Leu19-Pro24-Leu51）3個保守位點。

2.4 詩琳通木蘭bHLH家族基因在不同脅迫處理下的表達分析

在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（圖5）中，鹽堿脅迫30 d后，處理組相比對照組葉片有52個基因上調(diào)，14個基因下調(diào)，其中MsbHLH13、MsbHLH14、MsbHLH5、MsbHLH47、MsbHLH53、MsbHLH38、MsbHLH30顯著上調(diào)，MsbHLH52、MsbHLH15、MsbHLH58顯著下調(diào)；根受到鹽堿脅迫后的表達上調(diào)基因有25個，下調(diào)基因有43個，其中MsbHLH38顯著上調(diào)，MsbHLH5、MsbHLH62和MsbHLH53顯著下調(diào)，可見葉與根中顯著表達的基因有部分重合（MsbHLH38、MsbHLH5、MsbHLH53），表明這些重合的基因在鹽堿脅迫過程中可能同時對葉和根發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

2.5 詩琳通木蘭bHLH蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

基于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)所作熱圖的表達分析，對葉和根在脅迫中顯著表達的9個MsbHLH蛋白三維模型進行預(yù)測（圖6），圖6中所有蛋白三維結(jié)構(gòu)都具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)，也包含α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等蛋白基本空間構(gòu)象，9個蛋白三維結(jié)構(gòu)具有一定相似性，所有蛋白三維結(jié)構(gòu)序列同源性（sequence identity）都在20%以上。

3 討論

近年來，關(guān)于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)研究越來越多，擬南芥中已有30% bHLH基因功能陸續(xù)被鑒定［25］。bHLH作為植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫，通過與相關(guān)基因啟動子區(qū)域的順式元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)特定氨基酸殘基和靶基因轉(zhuǎn)錄表達，進而廣泛參與植物生命活動。

本研究共鑒定出72個詩琳通木蘭bHLH基因家族成員，相比其他植物中發(fā)現(xiàn)的bHLH基因家族成員數(shù)量，詩琳通木蘭bHLH基因家族成員數(shù)量相對較少。如擬南芥、大豆（Glycine max）、玉米、歐洲油菜（Brassica napus）、甘薯（Ipomoea batatas）、辣椒（Capsicum annuum）、白菜（Brassica rapa）、梨（Pyrus）分別鑒定出147、340、208、460、152、132、249、200個bHLH基因［26-33］，這可能是由于不同物種的基因組大小不同，同時在進化和生境方面也有差異，并且bHLH基因數(shù)量多的物種可能經(jīng)歷大規(guī)模的基因復(fù)制而導(dǎo)致bHLH基因不斷擴展，也可能測序組條件限制等原因?qū)е略谠娏胀咎m中還有尚未發(fā)現(xiàn)的bHLH基因［34-37］。分析MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn)有21個氨基酸殘基保守位點，保守性超過50%，其中有7個氨基酸殘基保守性超過75%，MsbHLH堿基區(qū)高度保守的Glu-5、Arg-6、Arg-8和Arg-9可能在DNA結(jié)合中扮演關(guān)鍵角色，而螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)的Leu-19、Pro-24、Leu-51相互作用可能在形成同源或異源二聚體發(fā)揮重要作用［38-39］。將詩琳通木蘭bHLH基因家族劃分23個亞族，在已報道的擬南芥bHLH基因中，同一亞家族成員進化關(guān)系越近，其基因結(jié)構(gòu)和基因功能越為相似［28，40］。同理，詩琳通木蘭同一亞家族的成員可能在功能和進化關(guān)系上也更加相似，如MsbHLH59、MsbHLH50、MsbHLH1和MsbHLH39這4個基因親緣關(guān)系相近，motif和基序完全一致，并且同亞族的motif和結(jié)構(gòu)域也具有相似的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，推測對應(yīng)的基因功能也相似。不同亞族內(nèi)基因的Motif和結(jié)構(gòu)域差異較大，猜測可能由于差異基因的結(jié)構(gòu)和motif組合導(dǎo)致bHLH基因功能的分化［41］。

鹽堿脅迫處理下，發(fā)現(xiàn)某些MsbHLH基因表達量有明顯差異。葉片中MsbHLH13、MsbHLH14、MsbHLH5、MsbHLH47、MsbHLH53、MsbHLH38、MsbHLH30顯著上調(diào)，MsbHLH52、MsbHLH15、MsbHLH58基因顯著下調(diào)；根中的MsbHLH38基因顯著上調(diào)，MsbHLH5、MsbHLH62、MsbHLH53基因顯著下調(diào)。在擬南芥耐鹽基因功能鑒定研究中，bHLH106過表達的KO擬南芥株型對NaCl表現(xiàn)出耐受性，同時bHLH106對鹽脅迫調(diào)控基因、耐鹽Zn-finger10（ZAT10）、鹽誘導(dǎo)Zn-finger1（SZF1）等非鹽脅迫相關(guān)基因進行正調(diào)控，以提高植物耐鹽性［42］。而MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子第11亞組包含bHLH106（At2g41130）， 通過對系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析發(fā)現(xiàn)，MsbHLH55和At2g41130親緣關(guān)系十分接近，推測MsbHLH55可能參與調(diào)控詩琳通木蘭某些

下游耐鹽基因表達以應(yīng)對鹽堿脅迫，需要后續(xù)驗證。

4 結(jié)論

本研究共鑒定出72個MsbHLH基因，對家族成員進行蛋白理化性質(zhì)、亞細胞定位及二級結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)分析，并對MsbHLH和擬南芥bHLH基因進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建，將72個基因家族成員分為23個亞家族，同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MsbHLH基因在鹽堿脅迫下的表達模式發(fā)生顯著差異，并找出11條可能在詩琳通木蘭鹽堿脅迫過程中發(fā)揮重要作用的基因，但其具體功能需驗證確定。本研究結(jié)果為進一步深入研究MsbHLH轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽堿脅迫的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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