楊家大　陳祥　龍威?！●T文武　丁玫

摘要：為了揭示雷公山山區(qū)放牧山羊乙酰輔酶A羧化酶1（ACCl）mRNA表達的組織分布規(guī)律，使用TaqMan實時熒光定量技術對黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和南江黃羊的肝、腎、心、肺、背最長肌、半膜肌以及皮下脂肪組織中ACCl基因的mRNA表達水平進行測定。結果表明，黔東南小香羊、黔北麻羊、南江黃羊ACCl mRNA均主要在皮下脂肪中表達，其水平分別為3 919.545 6、900.556 8、1 550.559 2；貴州黑山羊ACCl mRNA主要在肝臟內(nèi)表達，其水平為2 367.425 8；貴州白山羊ACCl mRNA主要在肌肉組織和肝臟中表達，其水平分別為背最長肌420.110 9，心351.436 l，半膜肌268.031 l，肝200.414 1。在皮下脂肪和肝臟，貴州白山羊ACCl mRNA的表達水平都明顯低于其他品種。由此可見，雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝臟中表達。

關鍵詞：雷公山山區(qū)；放牧山羊；乙酰輔酶1；羧化酶1；ACCl；基因表達

中圖分類號：S827.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0025-04

雷公山山區(qū)位于貴州省東南部，草場面積約1.3萬hm²，牧草種類多，工業(yè)污染少，非常適合發(fā)展生態(tài)養(yǎng)羊業(yè)。目前，當?shù)厝藗內(nèi)匝赜脗鹘y(tǒng)放牧的養(yǎng)羊方式，山羊生長過程中沉淀的風味物質(zhì)多，羊肉質(zhì)量好。乙酰輔酶A羧化酶（ace@一CoA carboxylase，ACC）是一類在脂肪代謝過程中起重要作用的生物素包含酶，催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酸單酰輔酶A。該酶廣泛存在于植物、動物、酵母、真菌、細菌、古細菌等生物體內(nèi)。在動物體內(nèi)，乙酰輔酶A羧化酶有乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACCα，別稱ACCl）和乙酰輔酶A羧化酶p（acetyl-CoA carboxylase beta，ACCp，別稱ACC2）2種類型，這2種酶由不同的基因編碼，分子量分別為265、280ku。ACCl主要存在于乳腺、脂肪組織和肝臟的細胞液內(nèi)，由它催化產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A主要用于合成脂肪酸，是脂肪酸合成時二碳單位的供體；而ACC2主要分布在心臟、肌肉組織和肝臟的線粒體外膜上，由它催化產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A主要用于調(diào)節(jié)肉堿棕櫚酸穿梭體。有研究表明，敲除ACC2基因的小鼠體內(nèi)丙二酸單酰輔酶A的含量低，導致脂肪酸的合成減少，氧化分解加快，脂肪組織和肝臟中堆積的脂肪減少，肝糖原含量下降；因此，乙酰輔酶A羧化酶可調(diào)節(jié)脂肪酸的生物合成和“β-”氧化，影響機體脂肪的代謝、沉積，進而影響背膘厚等肉質(zhì)性狀。然而，現(xiàn)有資料對家畜ACCl的研究多集中在基因多態(tài)性與泌乳性能的關聯(lián)以及基因啟動子方面，鮮見ACCl基因表達及其與肉質(zhì)性狀關系的研究；因此，本研究主要對雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl基因mRNA的組織分布進行探討，以摸清其組織表達規(guī)律，為肉質(zhì)性狀的遺傳標記輔助選擇積累基礎資料。

1.材料與方法

1.1山羊組織樣品來源

5～7月齡黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、南江黃羊各取4只（雌、雄各2只），體質(zhì)量14～17kg，均購自貴州省雷公山山區(qū)養(yǎng)羊戶處。將山羊放血處死后，迅速提取心、肝、肺、腎、背最長股、半膜肌、皮下脂肪組織，用錫箔紙包裹后投入液氮中。山羊處死前自由進食和飲水。

1.2引物及探針

PCR引物及TaqMan探針根據(jù)山羊ACCl及β-actm基因mRNA序列設計（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成及修飾。探針的5'、3'一分別由FAM（6一羧基熒光素）和TAMRA（6一羧四甲基羅丹明）修飾。

1.3總RNA提取

總RNA提取采用Invitrogen Trizol RNA試劑盒進行。操作簡述如下：在約50 mg經(jīng)液氮速凍的組織樣品中加入1mLTrizol溶液，混勻，裂解5min；加入200uL三氯甲烷，劇烈振蕩混勻，靜置2min；4℃、12000r/min條件下離心15min，吸取上層水相至另一個新的RNase—flee EP管中；加入等體積的異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r/min條件下離心10min，收集RNA沉淀；用75%乙醇洗滌2次，超凈臺風干；加入15～60uLRNase-flee水溶解沉淀。

1.4逆轉錄反應

逆轉錄反應采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit進行（20uL體系），具體步驟如下：取總量為0.1～2.Oug的總RNA，加RNase—flee H20混勻至14uL，置于65℃下變性5min，冷卻；再加5×RTbuffer4uL、逆轉錄酶1uL、RT引物1uL，于42℃下逆轉錄18min，然后于98℃下滅活逆轉錄酶5min；RT完畢岳將cDNA于一20℃下保存，按所需用量稀釋備用。

1.5實時熒光定量標準品的制備

PCR反應采用GeneSolution 2×Taq Master Mix（上海碩盟生物科技有限公司）進行，反應體系總體積為20uL，具體操作如下：向O.2 mL PCR管中依次加入RNase—flee H2O7.2uL、2×Taq Master Mix 10uL、10 t～mol/LS—F0.4uL、10umol/Ls—R0.4uL、cDNA 2uL，混勻。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性90s；94℃變性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸60s，40個循環(huán)；72℃延伸5min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收純化后，計算目的基因的拷貝數(shù)濃度，式中：Ⅳ為目的基因的拷貝數(shù)濃度（copies/uL），C為質(zhì)量濃度（ng/uL），M為擴增片段的堿基對數(shù)。經(jīng)計算，ACCl基因、β-actm基因的拷貝數(shù)濃度為1.39×101¹¹、3.53×10⁷copies/uL。

膠回收產(chǎn)物按4倍比例進行5次梯度稀釋。稀釋后再次測定質(zhì)量濃度、換算拷貝數(shù)濃度，最終得到拷貝數(shù)濃度為1.39×101¹¹、3.64×10l¹⁰、9.56×10⁹、2.39×10⁹、5.98×10⁸、1.49×10⁸eopies/p=L的ACCl基因連續(xù)梯度定量標準品，以及3.53×10⁷、8.82×10⁶、2.21×10⁶、5.51×10⁵、1.38×10⁵、3.45×10⁴copies/uL的β-actm基因連續(xù)梯度定量標準品。

1.6TaqMan PCR

反應在Funglyn FTC-3000實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Funglyn Bioteeh，INC，Canada）上進行，每個樣品設置3個重復，同時對空白對照及4倍連續(xù)梯度標準品進行定量PCR擴增。TaqMan PCR反應體系為20 p=L，其中含2×Realtime PCRMaster Mix 10.0uL、10umol/L前弓l物0.8uL、10umol/L反引物0.8uL、10umol/L TaqMan探針0.4uL、RNase-fleeH20 6.0uL、cDNA模板2.0uL。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性10min；每個循環(huán)包括95℃變性15 s，63℃退火及延伸60s，40個循環(huán)。

1.7統(tǒng)計分析

根據(jù)ACCl及β-actut基因連續(xù)梯度標準品的拷貝數(shù)的對數(shù)（以4為底）對相應Ct值作圖，得到對應基因的定量標準曲線及回歸方程。再根據(jù)回歸方程與樣品檢測得到的Ct值即可計算出待測樣品中ACCl基因及β-actm基因的拷貝數(shù)。ACCl mRNA的個體表達水平以ACCl基因的拷貝數(shù)與β-actm基因的拷貝數(shù)之比值表示，平均表達水平以“中位數(shù)”表示。

2.結果與分析

雷公山山區(qū)放牧的黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、南江黃羊等山羊品種肝、腎、心、肺、背最長肌、半膜肌、皮下脂肪組織中ACCl基因的mRNA表達水平見表2。

從表2可以看出，黔東南小香羊ACCl mRNA的表達水平以皮下脂肪最高，為3919.545 6，是心（573.7526）、肝（812.0987）、肺（691.6713）、腎（286.0498）、背最長?。?98.7109）和半膜肌（464.938 8）等組織的4.8倍以上；而肝、腎、心、肺、背最長肌、半膜肌中ACCl mRNA的表達水平較接近。黔北麻羊ACCl mRNA的表達水平以皮下脂肪和肺較高，分別為900.5568和900.1608，是心（542.6041）、肝（288.7994）、腎（579.7442）、背最長?。?18.3583）、半膜?。?72.1422）等組織的1.5倍以上。南江黃羊ACCl mRNA的表達水平以皮下脂肪最高，為1550.5592，是心（806.7845）、肝（803.6431）、肺（729.9683）、腎（519.4120）、背最長?。?13.832 6）、半膜肌（260.483 3）等組織的1.9倍以上。貴州黑山羊ACCl mRNA的表達水平在肝臟中最高，為2367.4258，是心（592.7209）、肺（762.8970）、腎（321.6677）、背最長?。?40.0147）、半膜?。?74.9263）、皮下脂肪（328.2781）等組織的3.1倍以上。貴州白山羊ACClmRNA的表達水平以背最長?。?20.11109）、心（351.4361）、半膜肌（268.0311）、肝（200.4141）、肺（110.6160）較高，皮下脂肪（77.4306）和腎（22.8188）較低。

此外，在皮下脂肪中，黔東南小香羊和南江黃羊ACClmRNA的表達水平很高，分別為3 919.5456和1 550.5592；其次是黔北麻羊，為900.5568；貴州黑山羊和貴州白山羊則相對較低，分別為328.2781和77.4306。在肝臟中，貴州黑山羊ACCl mRNA的表達水平最高，為2367.4258；黔東南小香羊和南江黃羊較高，分別為812.098 7和803.6431；黔北麻羊和貴州白山羊相對較低，分別為288.7994和200.4141。

3.結論與討論

3.1雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝臟中表達

肉質(zhì)性狀作為數(shù)量性狀，受多基因控制，目前發(fā)現(xiàn)的候選基因至少有十幾個。ACCl是體內(nèi)脂肪合成的關鍵酶之一，參與長鏈脂肪酸從頭合成的第1步反應，對調(diào)控肝組織的脂肪代謝活動具有重要作用，是豬屠宰及生產(chǎn)性能的標志。ACCl抑制劑能夠抑制小鼠體質(zhì)量增加，減少小鼠的肥胖程度。因此，檢測ACCl mRNA水平能夠在轉錄水平上反映體內(nèi)脂肪合成能力。本研究對5個品種山羊7種組織ACCl基因的表達進行測試，結果表明，有3個品種（黔東南小香羊、黔北麻羊和南江黃羊）_4CCl基因最主要在皮下脂肪組織中表達，1個品種（貴州黑山羊）主要分布于肝臟，另一品種（貴州白山羊）的優(yōu)勢表達組織器官不明確。這與Barber等的報道較相似：他們認為，哺乳動物中ACCl在所有細胞中表達，但主要在肝臟、脂肪組織以及泌乳期乳腺等脂肪生成組織中表達。本研究結果還顯示，在皮下脂肪組織中，黔東南小香羊、黔北麻羊和南江黃羊ACCl mRNA的表達水平個體差異較大，這可能是由于皮下脂肪是ACCl基因表達的最主要組織，外界環(huán)境和山羊自身條件的微小變化都能引起ACClmRNA表達水平的較大改變，日糧中的氨基酸、中草藥、維生素、金屬離子等成分以及飽餓狀態(tài)等因素都能影響ACCl基因的表達。雷公山山區(qū)生態(tài)環(huán)境優(yōu)美，氣候溫和濕潤，水質(zhì)好，植物種類繁多，有“天然藥園”之稱。該區(qū)放牧山羊長期攝食這些植物和草藥，不僅為其肌肉生長沉淀豐富的風味物質(zhì)，而且可以通過影響ACCl基因的轉錄、翻譯而最終影響屠宰性能，最終影響山羊的肉品質(zhì)量。

3.2ACCl mRNA的表達存在品種差異

就品種分布而言，無論是在表達水平最高的皮下脂肪中，還是在表達水平較高的肝臟中，貴州白山羊ACCl mRNA的表達水平都明顯低于其他山羊品種，這從轉錄層面說明貴州白山羊的肝臟和皮下脂肪組織中丙二酸單酰輔酶A的合成能力較弱，生成的丙二酸單酰輔酶A較少，合成脂肪酸的原料不足，脂肪的合成速率降低，分解加快。Solaiman等也發(fā)現(xiàn)，ACCl基因的表達具有品種差異，波爾山羊顯著高于Kiko山羊。