【關(guān)鍵詞】苓桂術(shù)甘湯；miR-140-5p/TLR4/NF-κB；潰瘍性結(jié)腸炎；腸黏膜屏障；免疫平衡

【中圖分類號(hào)】R574.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-03

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是常見的一種炎癥性腸道疾病，腹瀉、腹痛、膿血便、黏液便、體重減輕等是患者主要臨床癥狀，有時(shí)會(huì)伴有關(guān)節(jié)炎、肝膽管病等并發(fā)癥，患者病情遷延且易復(fù)發(fā)，是我國(guó)消化內(nèi)科常見的難治疾病[1-2]。UC作為一種腸道炎癥性疾病，Treg/Th17免疫平衡失衡引發(fā)的免疫炎癥在其發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡來進(jìn)行抗炎處理，可有效改善UC大鼠模型結(jié)腸炎癥狀[3]。miR-140-5p 是可調(diào)控炎癥反應(yīng)的一種RNA分子，可通過抑制炎癥而減輕莢膜梭菌β2 毒素誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞損傷[4]，Toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）是miR-140-5p的常見下游靶點(diǎn)，miR-140-5p可通過下調(diào)TLR4而抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[5]，而有研究表明TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)與UC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，抑制其激活可通過抗凋亡、抗氧化和抗炎而減輕UC大鼠結(jié)腸組織損傷[6]，并可促使Treg細(xì)胞分化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而通過恢復(fù)Treg/Th17細(xì)胞之間的免疫平衡、抑制免疫炎癥和重塑腸道微生物群而減輕UC小鼠結(jié)腸炎癥狀[7]，由此可知調(diào)控miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)可能是治療UC的有效措施。苓桂術(shù)甘湯是具有健脾利水和溫陽(yáng)化飲作用的經(jīng)典名方，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該方可起到明顯免疫調(diào)控、抗炎與細(xì)胞保護(hù)作用[8]，可上調(diào)急性心肌梗死大鼠腸組織緊密連接蛋白表達(dá)并降低炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而通過抑制炎癥而減輕其腸黏膜屏障損傷[9]，另外苓桂術(shù)甘湯還可阻斷TLR4/Myd88/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)并抑制心力衰竭大鼠炎癥[10]，因而推測(cè)苓桂術(shù)甘湯可能通過調(diào)控miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)介導(dǎo)UC 的發(fā)生發(fā)展過程，本文通過建立UC 大鼠模型，探究苓桂術(shù)甘湯調(diào)控miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)其腸黏膜屏障及免疫平衡的影響。

1材料

1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠（體質(zhì)量190～220 g，6周齡左右，SPF級(jí)），購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可SCXK（遼）2020-0001。在動(dòng)物飼養(yǎng)籠房中適應(yīng)喂養(yǎng)，每籠不超過5只，溫度23～25 ℃，濕度55%～65%，每日早晨更換新飼料并保證飼料、干凈飲用水充足，保證12 h/12 h明暗循環(huán)照明。

1.2 主要試劑及儀器

苓桂術(shù)甘湯（茯苓、桂枝、甘草、白術(shù)），各組成藥材飲片購(gòu)于安徽普仁中藥飲片有限公司；5%的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）水溶液（批號(hào)1029065），購(gòu)于北京中科儀友化工技術(shù)研究；一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒、miR-140-5p antagomir及其陰性對(duì)照、miR-140-5p、TLR4、β-actin與U6引物，購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；總RNA提取試劑（Trizol）、大鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17、IL-10與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，購(gòu)于上海愛必信生物科技有限公司；大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離液，購(gòu)于蘇州匯智和源生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4一抗（CD4-FITC）、PE標(biāo)記的抗大鼠IL-17A一抗（IL-17A-PE）、HRP 標(biāo)記的小鼠抗兔二抗、PE 標(biāo)記的抗大鼠Foxp3 一抗（Foxp3-PE）、兔源抗大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65與β-actin一抗，購(gòu)于英國(guó)Abcam公司等。

T 型超薄切片機(jī)、SM2010 R 切片機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Leica 公司；JEM-1400Flash透射電子顯微鏡，購(gòu)于日本電子株式會(huì)社；ASOOZ酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)于瑞士Tecan公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀，購(gòu)于上海貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易有限公司；QQ1000 熒光定量PCR 儀，購(gòu)于上海啟前電子科技有限公司；DYCZ-24DN垂直板電泳儀、DYY-7C電泳儀電源、WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)、DYCZ-TRANS2型轉(zhuǎn)印電泳儀，購(gòu)于北京市六一儀器廠等。

1.3 方法

1.3.1 建立UC大鼠模型及分組干預(yù) 參照文獻(xiàn)[11]用TNBS誘導(dǎo)建立UC 模型：取SD 大鼠禁食但自由飲水24 h，以40mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，于結(jié)腸內(nèi)（深入肛門約8 cm）注入4 mL/kg的5%TNBS+50%乙醇混合液，倒置大鼠并捏緊肛門，5 min后于頭低足高位放置，待其自然蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中繼續(xù)飼養(yǎng)3 d，若大鼠出現(xiàn)腹瀉、肛周污穢、稀便、便血等癥狀，表明UC模型建立成功，用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為5組：模型組、苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組、NCmiR-140-5p 組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p an?tagomir組，每組10只，另取10只大鼠以同樣方法向結(jié)腸內(nèi)注入等劑量生理鹽水+50%乙醇混合液，設(shè)為對(duì)照組。

取茯苓、桂枝、甘草、白術(shù)中藥飲片以4∶3∶3∶2的比例配比，加入10倍量的水浸泡、煮沸、過濾，然后再次加水重復(fù)1 次，將2 次的濾液進(jìn)行濃縮，并配制為生藥含量為0.42、0.84 g/mL的苓桂術(shù)甘湯液備用。各組大鼠于造模成功后進(jìn)行分組干預(yù)：苓桂術(shù)甘湯低劑量（4.2 g/kg）組、苓桂術(shù)甘湯高劑量（8.4 g/kg）組大鼠分別灌胃0.42、0.84 g/mL的苓桂術(shù)甘湯液10 mL/kg[9]，同時(shí)尾靜脈注射與苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir 組等劑量的生理鹽水；NC-miR-140-5p組大鼠灌胃10 mL/kg的生理鹽水，同時(shí)尾靜脈注射miR-140-5p陰性對(duì)照（溶于生理鹽水，劑量參考說明書）；苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir 組大鼠灌胃0.84 g/mL的苓桂術(shù)甘湯液10 mL/kg，同時(shí)尾靜脈注射miR-140-5p antagomir（溶于生理鹽水，劑量參考說明書）；模型組、對(duì)照組大鼠灌胃10mL/kg的生理鹽水，同時(shí)尾靜脈注射與苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir組等劑量的生理鹽水，灌胃時(shí)每天1次，尾靜脈注射是每周2次，各組大鼠均在干預(yù)3周后采集標(biāo)本做后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colon mucosa damage in?dex，CMDI）、結(jié)腸長(zhǎng)度并采集標(biāo)本 3周干預(yù)完成后24 h以乙醚麻醉各組大鼠，切開腹腔后自腹主動(dòng)脈采集大鼠外周血約2.5 mL，與等體積PBMC 分離液混勻后進(jìn)行離心分離出PBMC，洗滌計(jì)數(shù)后將其細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL備用；再次采集腹主動(dòng)脈學(xué)約1 mL，4 ℃、2 000 r/min、12 min離心后將上清（即血清）存在-20 ℃冰柜備用。

取大鼠肛門到回盲部的結(jié)腸，測(cè)量其長(zhǎng)度后評(píng)測(cè)CMDI，評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[12]：結(jié)腸黏膜無水腫、充血、潰瘍等損傷癥狀，0分；結(jié)腸黏膜水腫、充血但未發(fā)生潰瘍，1分；結(jié)腸黏膜水腫、充血并出現(xiàn)輕度糜爛，但未發(fā)生潰瘍，2分；結(jié)腸黏膜水腫、充血并出現(xiàn)中度糜爛，且發(fā)生單個(gè)潰瘍，3分；結(jié)腸黏膜水腫、充血并出現(xiàn)高度糜爛，且發(fā)生多處潰瘍，4分；結(jié)腸黏膜水腫、充血并出現(xiàn)重度糜爛，且發(fā)生gt;1 cm的潰瘍，5分。

取CMDI評(píng)測(cè)后的各組大鼠結(jié)腸，剪下距離肛門約2 cm的結(jié)腸0.5 cm，在4%戊二醛中固定后進(jìn)行梯度脫水、包埋、固化，用超薄切片機(jī)切為超薄片備用。再次剪下一段約5cm的結(jié)腸，取黏膜組織分為2份，一份加入Trizol試劑，于研缽內(nèi)研磨后提取其中總RNA，測(cè)出其濃度后存在-20 ℃冰柜備用；另一份結(jié)腸黏膜組織加入RAPI試劑，冰水浴中高速勻漿后提取其中總蛋白，用BCA法測(cè)出其濃度后存在-20 ℃冰柜備用。

1.3.3 透射電鏡觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu) 取1.4中的結(jié)腸黏膜組織超薄片，以醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染，用透射電鏡對(duì)結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和拍照。

1.3.4 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠外周血Treg、Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比值 取1.4中的PBMC細(xì)胞懸液0.1 mL，以CD4-FITC 抗體避光孵育后洗滌，用PBS 重懸細(xì)胞后以Foxp3-PE（或IL-17A-PE）抗體避光孵育后洗滌，對(duì)照管加入等量同型對(duì)照抗體，然后以4%多聚甲醛0.5 mL進(jìn)行重懸后上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Treg、Th17細(xì)胞比例并計(jì)算Treg/Th17比值。

1.3.5 ELISA檢測(cè)大鼠血清免疫炎癥相關(guān)因子水平 取1.4中的血清用冰水浴解凍，采用ELISA試劑盒測(cè)定其中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β1水平，具體檢測(cè)方法如試劑盒說明書中所示。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織miR-140-5p與TLR4 表達(dá) 取1.4 中的結(jié)腸黏膜組織總RNA，與miR-140-5p或TLR4、β-actin、U6引物、雙蒸水、酶預(yù)混液混勻制成20 μL的反應(yīng)體系，按照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒說明書中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)后得到各組miR-140-5p或TLR4、β-actin、U6基因循環(huán)閾值，以2-ΔΔCt 算法分析量化各組miR-140-5p、TLR4相對(duì)表達(dá)，miR-140-5p以U6為內(nèi)參對(duì)照，而TLR4 以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照，引物序列見表1。

1.3.7 免疫印跡法檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.4中的結(jié)腸黏膜組織總蛋白樣品，加熱變性后每組各取20 μg，上樣行電泳分離、濕式轉(zhuǎn)移，封閉蛋白非特異位點(diǎn)后孵育兔源抗大鼠TLR4或p-NF-κB p65、NF-κB p65、β-actin一抗，洗膜后用HRP標(biāo)記的小鼠抗兔二抗行抗原抗體反應(yīng)，用化學(xué)試劑顯影后拍照，用Image pro軟件定量各組蛋白灰度值，用內(nèi)參β-actin作對(duì)照量化各組TLR4或p-NF-κB p65、NF-κB p65相對(duì)表達(dá)，并計(jì)算p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)SPSS 24.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ ± s）進(jìn)行表示，多組間的差異比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩之間進(jìn)一步差異比較行LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CMDI評(píng)分與結(jié)腸長(zhǎng)度的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠CMDI 明顯升高（Plt;0.0001），結(jié)腸長(zhǎng)度明顯降低（Plt;0.000 1）。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠CMDI均降低（Plt;0.000 1、Plt;0.000 1），結(jié)腸長(zhǎng)度均升高（Plt;0.05）；NC-miR-140-5p組大鼠CMDI、結(jié)腸長(zhǎng)度無明顯變化（CMDI：P=0.9986；結(jié)腸長(zhǎng)度：P=0.999 6）。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠CMDI降低（Plt;0.000 1），結(jié)腸長(zhǎng)度升高（Plt;0.000 1）。與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir 組大鼠CMDI 升高（Plt;0.000 1），結(jié)腸長(zhǎng)度降低（Plt;0.000 1）。見表2。

2.2 各組大鼠腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)完好：上皮細(xì)胞間緊密結(jié)構(gòu)正常且細(xì)胞排列整齊，表面微絨毛結(jié)構(gòu)完整、清晰；模型組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重：上皮細(xì)胞間緊密結(jié)構(gòu)破損、不完整、不連續(xù)，表面微絨毛腫脹稀疏；與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)損傷均減輕且苓桂術(shù)甘湯高劑量組減輕程度更大，NC-miR-140-5p組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)損傷無明顯變化；與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir組大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)損傷加重。見圖1。

2.3 各組大鼠外周血Treg/Th17免疫平衡的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠Th17細(xì)胞比例明顯升高（Plt;0.000 1），Treg細(xì)胞比例、Treg/Th17比值明顯降低（Treg細(xì)胞比例：Plt;0.000 1；Treg/Th17 比值：Plt;0.000 1）。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠Th17細(xì)胞比例均降低（Plt;0.000 1、Plt;0.000 1），Treg細(xì)胞比例、Treg/Th17比值均升高（Treg細(xì)胞比例：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1；Treg/Th17 比值：P=0.000 6、Plt;0.000 1）；NC-miR-140-5p 組大鼠Th17 細(xì)胞比例、Treg 細(xì)胞比例、Treg/Th17 比值無顯著變化（Th17細(xì)胞比例：P=0.999 9；Treg細(xì)胞比例：P=0.999 7；Treg/Th17比值：Pgt;0.999 9）。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠Th17細(xì)胞比例降低（Plt;0.000 1），Treg細(xì)胞比例、Treg/Th17 比值升高（Treg 細(xì)胞比例：Plt;0.000 1；Treg/Th17比值：Plt;0.000 1）。與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir組大鼠Th17細(xì)胞比例升高（Plt;0.000 1），Treg細(xì)胞比例、Treg/Th17比值降低（Treg細(xì)胞比例：Plt;0.000 1；Treg/Th17比值：Plt;0.000 1）。見圖2、表3。

2.4 各組大鼠血清免疫炎癥相關(guān)因子水平的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-17水平明顯升高（IL-6：Plt;0.000 1；IL-17：Plt;0.000 1），IL-10、TGF-β1水平明顯降低（IL-10：Plt;0.000 1；TGF-β1：Plt;0.000 1）。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠血清IL-6、IL-17 水平均降低（IL-6：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1；IL-17：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1），IL-10、TGF-β1 水平均升高（IL-10：Plt;0.000 1、Plt;0.0001；TGF-β1：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1）；NC-miR-140-5p組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β1水平無明顯變化（IL-6：P=0.999 0；IL-17：P=0.922 4；IL-10：P=0.995 9；TGF-β1：Pgt;0.999 9）。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠血清IL-6、IL-17 水平降低（IL-6：Plt;0.000 1；IL-17：Plt;0.000 1），IL-10、TGF-β1水平升高（IL-10：Plt;0.000 1；TGF-β1：Plt;0.000 1）。與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir組大鼠血清IL-6、IL-17水平升高（IL-6：Plt;0.000 1；IL-17：Plt;0.000 1），IL-10、TGF-β1 水平降低（IL-10：Plt;0.000 1；TGF-β1：Plt;0.000 1）。見表4。

2.5 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織緊密連接蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1、claudin-4蛋白表達(dá)顯著降低（claudin-1：Plt;0.000 1；claudin-4：Plt;0.000 1）。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1、claudin-4蛋白表達(dá)均升高（claudin-1：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1；claudin-4：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1）；NC-miR-140-5p組大鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1、claudin-4蛋白表達(dá)無顯著變化（claudin-1：Pgt;0.999 9；claudin-4：P=0.999 6）。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1、clau?din-4 蛋白表達(dá)升高（claudin-1：Plt;0.000 1；claudin-4：Plt;0.000 1）。與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir 組大鼠結(jié)腸黏膜組織claudin-1、claudin-4蛋白表達(dá)降低（claudin-1：Plt;0.000 1；claudin-4：Plt;0.000 1）。見圖3、表5。

2.6 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織miR-140-5p/TLR4/NF-κB 信號(hào)相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著升高（TLR4 mRNA：Plt;0.000 1；TLR4蛋白：Plt;0.000 1；p-NF-κB p65/NF-κB p65：Plt;0.000 1），miR-140-5p表達(dá)顯著降低（Plt;0.000 1）。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組、苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（TLR4 mRNA：Plt;0.000 1、Plt;0.000 1；TLR4蛋白：Plt;0.000 1、Plt;0.0001；p-NF-κB p65/NF-κB p65：Plt;0.0001、Plt;0.000 1），miR-140-5p表達(dá)均升高（Plt;0.000 1、Plt;0.0001）；NC-miR-140-5p組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65/NF-κB p65、miR-140-5p表達(dá)無顯著變化（TLR4 mRNA：P=0.999 8；TLR4蛋白：P=0.995 9；p-NF-κB p65/NF-κB p65：P=0.999 2；miR-140-5p：Pgt;0.999 9）。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低（TLR4 mRNA：Plt;0.000 1；TLR4 蛋白：Plt;0.000 1；p-NF-κB p65/NF-κB p65：Plt;0.000 1），miR-140-5p 表達(dá)升高（Plt;0.000 1）。與苓桂術(shù)甘湯高劑量組比較，苓桂術(shù)甘湯高劑量組+miR-140-5p antagomir 組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4mRNA 與蛋白表達(dá)、p-NF-κB p65/NF-κB p65 升高（TLR4mRNA：Plt;0.000 1；TLR4蛋白：Plt;0.000 1；p-NF-κB p65/NF-κB p65：Plt;0.000 1），miR-140-5p表達(dá)降低（Plt;0.000 1）。見圖4，表6。

3 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，我國(guó)UC患病人數(shù)逐年提升，已成為亟需解決的臨床問題，如今主要依賴藥物控制UC癥狀，皮質(zhì)類固醇類激素、水楊酸類藥物、免疫抑制劑等是常用藥物，但會(huì)引發(fā)腹瀉、發(fā)燒、皮疹、腎損傷、抽筋等諸多毒副作用，嚴(yán)重限制了其臨床療效，因而需探尋無毒副作用的安全治療方法[13-14]。本文采用TNBS誘導(dǎo)建立UC模型，結(jié)果顯示，大鼠出現(xiàn)腹瀉、肛周污穢、稀便、便血等癥狀，其CMDI升高而結(jié)腸長(zhǎng)度降低，揭示UC模型建立成功。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃虛弱、運(yùn)化失司、濕熱蘊(yùn)結(jié)是UC 的主要病機(jī)，治療應(yīng)以溫陽(yáng)健脾、清熱燥濕為主，苓桂術(shù)甘湯是張仲景所著《傷寒雜病論》中的經(jīng)典方劑，由茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草組成，茯苓作為君藥健脾、利水、化飲，桂枝作為臣藥降逆平?jīng)_、溫陽(yáng)化氣，白術(shù)作為佐藥健脾燥濕，甘草調(diào)和諸藥使其共奏健脾利水、溫陽(yáng)燥濕之功，研究顯示苓桂術(shù)甘湯可顯著調(diào)節(jié)心衰小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)其腸黏膜屏障[15]，而加味苓桂術(shù)甘湯能保護(hù)腎纖維化大鼠腸黏膜[16]，因而推測(cè)苓桂術(shù)甘湯可能對(duì)UC具有治療作用。本文結(jié)果顯示，以苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療UC大鼠，可減輕大鼠結(jié)腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)損傷，降低其CMDI、Th17 細(xì)胞比例、血清IL-6 與IL-17 水平，升高其結(jié)腸長(zhǎng)度、Treg 細(xì)胞比例、Treg/Th17 比值、血清IL-10與TGF-β1水平、結(jié)腸黏膜組織clau?din-1、claudin-4蛋白表達(dá)，表明苓桂術(shù)甘湯可促使Treg細(xì)胞分化及其抗炎細(xì)胞因子IL-10與TGF-β1產(chǎn)生釋放，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分化及其促炎細(xì)胞因子IL-6與IL-17產(chǎn)生釋放，繼而減輕Treg/Th17免疫失衡引發(fā)的免疫炎癥，揭示苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)控Treg/Th17免疫平衡并促使其向Treg偏移來抑制免疫炎癥，進(jìn)而減輕結(jié)腸黏膜屏障損傷，最終改善其結(jié)腸炎癥狀。

miR-140-5p/TLR4/NF-κB是調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥及免疫穩(wěn)態(tài)等過程的重要信號(hào)，上調(diào)miR-140-5p可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)激活，進(jìn)而通過抑制炎癥因子分泌而減輕多溴二苯醚-47誘導(dǎo)的草魚腎細(xì)胞損傷[17]，還可通過抑制細(xì)胞凋亡與炎癥而減輕糖尿病誘導(dǎo)的大鼠腎損傷[18]，阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡而保護(hù)UC大鼠腸上皮屏障，重塑紊亂的腸道微生物群和Treg/Th17 免疫平衡，進(jìn)而緩解其結(jié)腸炎癥狀[7，19-20]。本文結(jié)果顯示，UC 大鼠結(jié)腸黏膜組織miR-140-5p 表達(dá)相比對(duì)照組顯著降低而TLR4mRNA、蛋白表達(dá)與p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著升高，以苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療可逆轉(zhuǎn)UC大鼠上述因子變化趨勢(shì)，表明miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)參與介導(dǎo)苓桂術(shù)甘湯對(duì)UC大鼠腸黏膜屏障功能及免疫平衡的改善作用；以苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療UC大鼠的同時(shí)下調(diào)miR-140-5p表達(dá)，可減弱苓桂術(shù)甘湯單獨(dú)干預(yù)對(duì)UC大鼠Treg細(xì)胞分化及其抗炎細(xì)胞因子IL-10與TGF-β1產(chǎn)生釋放的促進(jìn)作用，同時(shí)減弱其對(duì)UC大鼠Th17細(xì)胞分化及其促炎細(xì)胞因子IL-6與IL-17產(chǎn)生釋放的抑制作用，最終削弱苓桂術(shù)甘湯頓渡干預(yù)對(duì)UC 大鼠免疫炎癥的減輕作用，揭示苓桂術(shù)甘湯可通過促使Treg/Th17免疫平衡向Treg偏移來抑制Treg/Th17免疫失衡引發(fā)的免疫炎癥；另外以苓桂術(shù)甘湯干預(yù)治療UC大鼠的同時(shí)下調(diào)miR-140-5p表達(dá)，可減弱苓桂術(shù)甘湯單獨(dú)干預(yù)對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)及NF-κB磷酸化的抑制作用，降低了TLR4/NF-κB信號(hào)活性，并拮抗苓桂術(shù)甘湯單獨(dú)干預(yù)對(duì)UC大鼠免疫炎癥與結(jié)腸黏膜屏障損傷的減輕作用，最終逆轉(zhuǎn)其對(duì)UC大鼠結(jié)腸炎癥狀的緩解作用，揭示苓桂術(shù)甘湯改善UC大鼠免疫平衡穩(wěn)態(tài)并減輕其腸黏膜屏障損傷可能是通過上調(diào)miR-140-5p 來抑制TLR4/NF-κB信號(hào)激活實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，苓桂術(shù)甘湯可通過上調(diào)miR-140-5p而降低TLR4蛋白表達(dá)及NF-κB磷酸化，進(jìn)而調(diào)控UC 大鼠Treg/Th17 免疫平衡并促使其向Treg 偏移，減輕其免疫炎癥及結(jié)腸黏膜屏障損傷，最終緩解大鼠結(jié)腸炎癥狀，阻斷miR-140-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可能是其治療UC大鼠的藥理機(jī)制，本文為UC的臨床治療提供了新的藥物候選，有助于其臨床治療技術(shù)的改進(jìn)和患者預(yù)后的改善。