【關(guān)鍵詞】慢性乙型肝炎；環(huán)狀RNA；高通量芯片；實時熒光定量PCR

【中圖分類號】R183.9 【文獻標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-12

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）仍然是全球范圍的主要健康負(fù)擔(dān)，尤其是在中國[1-2]。世界衛(wèi)生組織報告稱，2019年全球約有300萬新發(fā)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者和2.96億慢性HBV 感染者[3]。HBV 感染是誘發(fā)主要CHB患者形成發(fā)展的直接因素，也是誘發(fā)肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等嚴(yán)重肝臟疾病的關(guān)鍵原因[4]。雖然近年乙型肝炎疫苗接種率有一定提高，HBV 感染率有所下降，但CHB患者人數(shù)仍然居高不下。迄今為止，CHB的分子機制尚不完全清楚[5]。此外，CHB進展的不可預(yù)測性也阻礙了CHB的治療[6]。臨床上，CHB的治療具有時間長、治療效果差、預(yù)后差等特點，對人體健康產(chǎn)生巨大的負(fù)面影響[7]。因此，優(yōu)化或探索更完善的治療方法極為重要。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在前mRNA階段由外顯子、內(nèi)含子或2者組合進行反向剪接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。circRNA具有RNAse R耐受和抗核酸酶活性，比線性RNA穩(wěn)定[8]。伴隨高通量芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析的快速發(fā)展，在真核轉(zhuǎn)錄組中已經(jīng)鑒定出許多circRNA[9]。circRNA 在CHB 患者肝臟組織中具有差異表達[10]。大量研究證實，circRNA通過競爭性結(jié)合微小RNA（microRNA，miRNA）并充當(dāng)海綿或誘餌，抑制miRNA 活性，從而調(diào)節(jié)基因表達和細(xì)胞功能[11-14]。由此猜想，CHB患者血清外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中可能也存在一些異常表達的circRNAs，通過吸附miRNA 影響CHB 的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究應(yīng)用高通量芯片和生物信息學(xué)技術(shù)分析cir?cRNA表達譜，尋找有效的分子靶點，為更深入的機制研究提供數(shù)據(jù)支持和研究思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

圖1展示本研究技術(shù)路線圖。本研究招募的24例CHB患者來源于2021年4月至6月在重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院感染科就診人員，24例年齡和性別匹配的健康對照為2021年4至5月在重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院體檢人員。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會支持，并遵循知情同意原則。CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為18～60歲；②HBsAg血清陽性且持續(xù)時間超過6個月，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》；③同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病毒性感染，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒；②合并有冠心病、慢性阻塞性肺氣腫、終末期腎臟病、非小細(xì)胞肺癌等嚴(yán)重慢性疾病；③病歷資料不全。健康對照組沒有任何HBV感染史，HBV標(biāo)志物檢測陰性且生化肝功能正常。健康對照組不一定接受過HBV檢測，本研究主要納入肝功能檢測指標(biāo)進行分析，結(jié)果如表1所示。

1.2 血樣采集及外周血單核細(xì)胞提取

使用肝素抗凝管和EDTA抗凝管分別采集2 mL和5 mL受試者外周靜脈血，24 h內(nèi)完成處理。其中肝素抗凝血用于檢測臨床生化指標(biāo)；EDTA抗凝血離心后，吸取中間淋巴細(xì)胞層，使用人全血單個核細(xì)胞分離液（灝洋生物，中國）提取PBMCs。

1.3 高通量芯片檢測

本研究選取5例CHB患者和5例健康對照PBMCs樣本進行芯片分析。按照制造商說明，使用RNeasy總RNA分離試劑盒（qiagen，gmBH，Germany）和Trizol試劑（Life technolo?gies，Carlsbad，CA，US）分離總RNA，并使用RNeasy Mini試劑盒（qiagen，gmBH，Germany）進行RNA 純化。通過AgilentBioanalyzer 2100（agilent technologies，Santa Clara，CA，US）檢查樣本中總RNA完整性。利用各組RNA樣品生成生物素化cRNA靶標(biāo)，隨后將cRNA靶標(biāo)與載玻片雜交。掃描過程在Agilent芯片掃描儀（agilent technologies，Santa Clara，CA，US）上完成。使用特征提取軟件10.7（agilent technologies，SantaClara，CA，US）進行數(shù)據(jù)提取。用R 軟件“l(fā)imma”包中的quantile算法對原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

1.4 circRNA的鑒定和特征分析

首先計算2 組間circRNA 的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），進而得到log2FC。通過R 軟件中“ggplot2”包繪制cir?cRNA 的散點圖和火山圖，“pheatmap”包進行聚類熱圖分析。當(dāng)|log2FC|≥1，Plt;0.05 認(rèn)為2 組間circRNA 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 GO和KEGG功能富集分析

基因本體論（gene ontology，GO）通過定義基因產(chǎn)物的功能，被廣泛應(yīng)用于基因、基因產(chǎn)物和序列注釋。京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）用于分析基因的潛在生物學(xué)功能。本研究對cir?cRNA對應(yīng)的來源基因進行富集分析，以闡明受circRNA影響的特定生物學(xué)過程，深入了解其作用機制。當(dāng)Plt;0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率小于0.1時被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，得到基因集富集結(jié)果。

1.6 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用circBase數(shù)據(jù)庫獲取差異circRNA基本信息。通過circinteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測前10個上調(diào)circRNA和前10個下調(diào)circRNA 吸附miRNA。使用miRDB、miRTarBase 和Tar?getScan 數(shù)據(jù)庫同時預(yù)測miRNA 結(jié)合靶mRNA，篩選出3個數(shù)據(jù)庫同時預(yù)測到的miRNA結(jié)合mRNA?？梢暬治鍪褂肅ytoscape 3.9.0完成。

1.7 實時熒光定量PCR驗證circRNA表達

鑒于circRNA的表達量變化差異及重要性，本研究選擇8個差異表達circRNAs，根據(jù)circRNA引物設(shè)計原則設(shè)計特異性引物。通過實時熒光定量PCR（quantitative real-timePCR，qRT-PCR）檢測與微陣列分析相同的樣本中circRNA相對表達量，進一步檢測所有樣本具有最高意義的2個cir?cRNAs。用Trizol試劑提取PBMCs樣本中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT Master Mix for qPCR，MCE，USA）的說明合成cDNA，采用熒光染料法進行擴增。使用的SYBR GreenqPCR Master Mix購自MCE公司，特異性引物由上海生工合成，見表2。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 4.2.2、IBM SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0軟件進行繪圖和統(tǒng)計分析。使用來自至少3個獨立實驗的數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計學(xué)意義。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，采用卡方檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 差異表達circRNA篩選

芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)進行歸一化后繪制散點圖和火山圖。如圖2A散點圖所示，2組數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢較好，表明歸一化結(jié)果可靠。如圖2B火山圖所示，與健康對照組相比，CHB患者PBMCs中共有870個circRNAs的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異，包括321個表達上調(diào)circRNAs和549個表達下調(diào)circRNAs。分層聚類分析表明，circRNA在2組樣本中的表達模式具有差異（圖2C）。表3展示前10個上調(diào)和下調(diào)circRNAs。

2.2 差異circRNA特征分析

為了進一步了解差異circRNA，對CHB患者和健康對照組PBMCs中上調(diào)和下調(diào)circRNA進行了特征分析。結(jié)果如圖3A所示，這些差異表達circRNA廣泛分布在除性染色體Y以外的所有染色體中，其中1號和2號染色體承載數(shù)量最多的circRNA。本研究統(tǒng)計了870 個差異circRNA 的產(chǎn)生方式，其中88.85%的circRNA來源于exon的剪接，7.47%的差異circRNA 來源于intergenic，極少數(shù)來源于intron（圖3B）。大多數(shù)失調(diào)的circRNA的長度小于2000個核苷酸，中位長度為733.5個核苷酸（圖3C）。

2.3 circRNA來源基因功能通路分析

GO富集通路結(jié)果顯示上調(diào)circRNA來源基因顯著富集在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)術(shù)語（圖4A），而下調(diào)circRNA主要在囊泡、細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架富集較多（圖4B）。KEGG富集分析表明，CHB中上調(diào)circRNA來源基因涉及幾種常見的通路，mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和Rap1信號通路（圖4C）。下調(diào)circRNA來源基因除了富集于常見的白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、ErbB 信號通路和Rap1 信號通路外，還參與多種細(xì)菌感染（耶爾森氏菌感染、致病性大腸桿菌感染）通路（圖4D）。

2.4 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為進一步探索差異circRNA在CHB中的潛在作用，本研究擬構(gòu)建circRNA、miRNA及mRNA組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)探尋其相互作用關(guān)系。首先，通過生物信息學(xué)預(yù)測得到前10個上調(diào)和下調(diào)circRNA 的吸附miRNA。接下來，通過miRDB、miRTarBase 和TargetScan 在線數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測上述得到的miRNA對應(yīng)的mRNA，得到639個miRNA-mRNA對，其中存在427個重復(fù)基因。最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0顯示該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括11個circRNA節(jié)點，17個miRNA節(jié)點以及212個mRNA節(jié)點，如圖5所示。

2.5 差異circRNA表達驗證

首先使用qRT-PCR 檢測與芯片分析相同的CHB 患者和健康對照組PBMC 中circRNA 表達。與對照組相比，hsa_circ_0018744、hsa_circ_0018455、hsa_circ_0055625 及hsa_circ_0000081 表達在CHB 組中顯著上調(diào)（F=2.832，Plt;0.01；F=0.205，Plt;0.05；F=1.225，Plt;0.05；F=2.439，Plt;0.01），同時，與對照組比較，hsa_circ_0015269、hsa_circ_0085744和hsa_circ_0080913 的表達在CHB 組中顯著下調(diào)（F=38.335，Plt;0.01；F=2.414，Plt;0.01；F=15.367，Plt;0.01），但hsa_circ_0028075表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.541，P=0.053；圖6A）。進一步發(fā)現(xiàn)與24例健康對照組比較，hsa_circ_0018744表達在24 例CHB 患者中明顯上調(diào)（F=4.382，Plt;0.01），hsa_circ_0085744表達顯著下調(diào)（F=4.906，Plt;0.05；圖6B）。以上結(jié)果與芯片檢測一致，表明芯片結(jié)果具有可靠性。

3 討論

本研究采用高通量芯片技術(shù)，展示CHB 患者PBMCs中circRNA表達譜，探究了CHB患者發(fā)生發(fā)展的潛在調(diào)控機制。芯片表達譜分析結(jié)果表明，與健康對照組相比，大量circRNAs在CHB中具有差異表達，且差異倍數(shù)在2 倍以上，表明這些差異cir?cRNAs可能與CHB的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CHB相關(guān)差異circRNA來源基因GO分析結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)育生長、細(xì)胞分化和活性調(diào)節(jié)是明顯富集的生物學(xué)過程。KEGG富集分析顯示，來源基因主要在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、mTOR 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和Rap1信號通路中富集。以上結(jié)果提示感染通路、免疫和炎癥反應(yīng)在CHB中明顯失調(diào)，表明差異表達circRNA 可能在HBV 感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15-18]。

本研究通過生物信息學(xué)分析分別預(yù)測circRNA和mRNA 的多個miRNA 吸附位點。在預(yù)測的cir?cRNA吸附miRNA中，miR-212-3p在HBeAg處理的細(xì)胞中上調(diào)，并通過靶向MAPK1抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[19]。其他吸附miRNA與CHB的發(fā)病機制是否相關(guān)尚需進一步研究。此外，TGFBR2[20]、IGF1R[21]和DDX17[22]等靶mRNA與HBV感染和CHB相關(guān)疾病之間存在密切聯(lián)系。通過qRT-PCR證實，7個circRNAs相對表達量與芯片表達的趨勢基本一致，且具有統(tǒng)計學(xué)差異性。特別地，本研究選擇差異表達最明顯的circRNAs在所有患者中進行qRTPCR檢測。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，hsa_circ_0018744和hsa_circ_0085744在CHB患者中明顯失調(diào)。盡管目前還未見這些差異circRNAs與HBV感染相關(guān)的報道，有研究證實這些circRNAs與某些疾病的相關(guān)性[23-24]。另有報道發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0018744和hsa_circ_0085744 來源基因DDIT4 和PTK2 可能是HBV 相關(guān)HCC 的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[25-26]。以上結(jié)果均表明hsa_circ_0018744 和hsa_circ_0085744可能作為CHB的潛在有價值的新型標(biāo)志物。

綜上所述，鑒于circRNA在疾病或病毒中的重要作用，本研究基于高通量芯片技術(shù)篩選并驗證CHB中差異表達的circRNA。進一步分析發(fā)現(xiàn)差異表達circRNAs 可能參與CHB 的發(fā)病機制，作為CHB患者潛在的治療靶點。本研究的局限性在于circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在機制尚不清楚，未通過具體實驗驗證準(zhǔn)確性。接下來的研究應(yīng)進一步驗證這些候選標(biāo)志物在體內(nèi)和體外對CHB的影響。