摘要［目的］探究不同連作年限西紅花種植土壤中細(xì)菌和真菌群落多樣性以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征。［方法］采用高通量測序技術(shù)分析不同連作年限西紅花種植土壤微生物群落的多樣性、組成以及網(wǎng)絡(luò)特征差異。［結(jié)果］不同連作年限西紅花種植土壤細(xì)菌和真菌的多樣性發(fā)生明顯變化，尤其是真菌的OTUs、Shannon、Simpson、Chao和ACE指數(shù)，隨著連作年限增加呈現(xiàn)明顯增加的趨勢。主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維尺度分析（NMDS）結(jié)果表明，不同連作年限西紅花種植土壤中細(xì)菌和真菌群落組成均有明顯差異。放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸酐菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）為4個(gè)不同連作年限西紅花種植土壤中豐度前5位的細(xì)菌門。子囊菌門（Ascomycota）在4個(gè)連作年限中均為第一大真菌門（相對(duì)豐度gt;55%）。種植4年的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度低于種植1年、2年和3年。產(chǎn)油菌屬（Solicoccozyma）在連作4年西紅花土壤中豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）。細(xì)菌和真菌的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析表明，不同連作年限西紅花種植土壤細(xì)菌和真菌呈現(xiàn)不同的連接模式。［結(jié)論］該研究描繪了不同連作年限西紅花種植土壤微生物多樣性、組成以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異，從微生物角度探討西紅花連作障礙機(jī)制，為解決西紅花的連作障礙提供參考。

關(guān)鍵詞西紅花；連作年限；土壤微生物；多樣性；網(wǎng)絡(luò)特征

中圖分類號(hào)R282.2"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A"文章編號(hào)0517-6611（2024）24-0137-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

DifferencesofMicrobialDiversityandNetworkCharacteristicsinCrocussativus-PlantingSoilofDifferentContinuousCroppingYears

LIMeng-zhi1，F(xiàn)ENGMao2，GAOLi1etal

（1.HenanKeyLaboratoryofZhangZhongjingFormulaeandHerbsforImmunoregulation，NanyangInstituteofTechnology，Nanyang，Henan473000;2.NanyangInstituteofTechnology，Nanyang，Henan473000）

Abstract［Objective］ToexplorethediversityandnetworkstructureofbacterialandfungalcommunitiesinsoilmicroorganismofCrocussativusindifferentyearsofcontinuouscropping.［Method］High-throughputsequencingwascarriedouttodeterminethediversity，compositionandnetworkstructureofbacterialandfungalcommunitiesinsoilmicroorganismofC.sativus.［Result］ThediversityofbacteriaandfungiinsoilofC.sativushadsignificantchanges，especiallytheOTUs，Shannon，Simpson，ChaoandACEindicesoffungi，whichshowedasignificantincreasetrendwiththeincreaseofcontinuouscroppingyears.TheresultsofPCoAandNMDSshowedthatthereweresignificantdifferencesinthecompositionofbacteriaandfungiinsoilofC.sativusindifferentyearsofcontinuouscropping.Atthebacterialphylumlevel，Actinobacteria，Proteobacteria，Acidobacteria，ChloroflexiandPlanctomyceteswerethetopfivephyla.Atthefungalphylumlevel，Ascomycota（55%）wasthemostabundantphylum.TherelativeabundanceofActinobacteriaandGemmatimonadeteswerelowerinsoilsofcontinuouscropping4yearthancontinuouscropping1，2and3year.TherelativeabundanceofSolicoccozymawassignifcantlyhigherinsoilsofcontinuouscropping4yearthancontinuouscropping1，2and3year（Plt;0.05）.ThereweredifferentconnectivitypatternsofbacteriaandfungiinC.sativus-plantingsoilofdifferentcontinuouscroppingyears.［Conclusion］Thestudydescribesthedifferencesofmicrobialdiversity，compositionandnetworkstructureinC.sativus-plantingsoilofdifferentcontinuouscroppingyears，andexploresthemechanismofC.sativuscontinuouscroppingobstaclesfromamicrobialperspective，providingreferenceforsolvingtheobstaclesofcontinuouscroppinginC.sativus.

KeywordsCrocussativus;Continuouscroppingyears;Soilmicroorganism;Diversity;Networkcharacteristic

西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭^［1］。西紅花主要在伊朗、西班牙、摩洛哥、土耳其、印度、希臘、意大利等地種植，目前在我國主要產(chǎn)地為上海、浙江、安徽和河南等?。ㄊ校?sup>［^2-3］。相關(guān)的研究表明，西紅花的柱頭具有較多的藥理作用，例如抗氧化、抗炎、抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)、保肝等，這些療效主要來源于藏紅花素、藏紅花苷和藏紅花醛3個(gè)主要活性成分^［4］。由于西紅花的化學(xué)成分具有重要的藥理作用，導(dǎo)致西紅花的重要性和需求顯著增加^［5］。然而，由于各種因素的影響，近幾十年來世界范圍內(nèi)西紅花的生產(chǎn)和種植呈下降趨勢^［6］。西紅花的產(chǎn)量可能受到低溫、干旱、水澇以及病原菌的影響^［2］。

西紅花為多年生藥用植物，連續(xù)種植使病蟲害加重，導(dǎo)致西紅花的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，連作障礙明顯^［2］。土壤微生物在土壤功能中扮演重要角色，尤其是在調(diào)節(jié)植物生長、產(chǎn)量、品質(zhì)等方面^［7］。土壤中微生物的數(shù)量、種類、多樣性以及群落結(jié)構(gòu)對(duì)于維持土壤系統(tǒng)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能至關(guān)重要^［8］。前人很多的研究結(jié)果證實(shí)，連作打破了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，作為藥用植物三七（Panax notoginseng）^［9］、人參（Panax ginseng）^［10］、地黃（Rehmannia glutinosa）^［11］等產(chǎn)生連作障礙的一個(gè)重要原因。連作改變土壤微生物多樣性和組成，對(duì)土壤生產(chǎn)力和作物產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響^［12］。然而，由于西紅花在我國種植歷史不長，目前鮮見西紅花不同連作年限土壤微生物多樣性、群落組成的研究。因此，全面解析不同連作年限西紅花土壤微生物多樣性、群落組成，對(duì)于解析西紅花連作障礙發(fā)生機(jī)制及預(yù)防其發(fā)生具有重要意義。該研究通過高通量測序獲得不同連作年限西紅花土壤微生物群落多樣性和組成，闡明不同連作年限西紅花種植土壤微生物的多樣性、組成以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異，以期為解決西紅花連作障礙提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

2021年10月20日（西紅花花期）在河南省南陽市臥龍區(qū)蒲山鎮(zhèn)馬營村西紅花種植基地采集土壤樣本。分別采集連續(xù)種植西紅花1年、2年、3年和4年的耕作層土壤，分別標(biāo)記為CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y，每個(gè)種植年限選取3個(gè)種植小區(qū)，小區(qū)面積為4.0m×1.5m=6m2。采取五點(diǎn)取樣法用土鉆采集深度為0～20cm的耕層土壤放入無菌袋中，將5個(gè)點(diǎn)的土壤樣品混在一起，作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共獲得12個(gè)土壤樣本。將土壤樣本置于冰上運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DNA提取與PCR擴(kuò)增

取0.5 g土壤樣品，按照試劑盒（Fast DNA TM Spin kit for soil）操作流程進(jìn)行，獲得土壤總DNA，用Nanodrop 2000對(duì)DNA樣本的濃度和純度進(jìn)行檢測；使用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，檢測合格的NDA用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT -3′）^［13］；真菌ITS的ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為ITS3_KYO2（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′）^［14］。將上述引物分別合成帶有barcode標(biāo)簽的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［15］進(jìn)行。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增子）連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，在廣州基迪奧生物科技有限公司的illumina Hiseq TM2500平臺(tái)上機(jī)測序。

1.3生物信息學(xué)分析

測序得到Raw reads，運(yùn)用FASTP（version 0.18.0）過濾低質(zhì)量的reads，利用FLSAH（version 1.2.11）將雙端reads拼接為tag。為了獲得高質(zhì)量的clean tags，通過過濾條件將 raw tags 中的噪聲序列過濾，然后運(yùn)用UPARSE（version 9.2.64）系統(tǒng)將相似度≥97%的clean tags 聚類成OTUs^［16］。運(yùn)用UCHIME算法將所有嵌合體的tags去除^［17］。16S和ITS的代表性序列集合使用RDP Classifier 的Nave Bayesian assignment 算法分別依據(jù)SILVA 和ITS2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋（設(shè)定置信度的閾值為0.8）^［18-19］。多樣性指數(shù)通過QIIME軟件（http：//qiime.org/index.html）計(jì)算?；贐ray-unifrac距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）和基于Weighted-unifrac距離的非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling ordination，NMDS），通過R語言作圖。運(yùn)用Linear discriminant analysis effect size（LEfSe，v1.9.0）篩選西紅花不同種植年限土壤中差異的微生物菌群^［20］?！肮舶l(fā)生”分析通過Python中的“SparCC”模塊實(shí)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)圖的可視化和屬性測量利用交互平臺(tái)Gephi進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

不同連作年限西紅花種植土壤微生物細(xì)菌和真菌測序結(jié)果、多樣性指數(shù)、群落組成（門和屬水平）顯著性差異用SPSS21.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同種植年限差異顯著性采用Duncan法計(jì)算（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同連作年限對(duì)西紅花種植土壤微生物多樣性的影響

對(duì)于細(xì)菌，CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y分別獲得2665、2929、3168、3040個(gè)OTUs；對(duì)于真菌，CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y分別獲得311、378、470、482個(gè)OTUs（表1）；隨著連作年限的延長，耕作土壤中細(xì)菌和真菌的OTUs數(shù)量總體呈現(xiàn)增加的趨勢，說明連作使土壤中細(xì)菌和真菌的種類增加。對(duì)4個(gè)不同連作年限土壤細(xì)菌和真菌的alpha多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），連續(xù)種植2、3、4年的西紅花土壤Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于種植1年西紅花土壤（Plt;0.05），連續(xù)種植2、3、4年的西紅花土壤Simpson指數(shù)高于種植1年西紅花土壤?；贐ray-curtis距離的細(xì)菌和真菌PCoA分析結(jié)果（圖1a）表明，不同連作年限西紅花土壤微生物群落組成有顯著差異（細(xì)菌R2=0.77，P=0.001，真菌R2=0.56，P=0.002）。同樣基于Weighted-unifrac距離的NMDS分析結(jié)果（圖1b）顯示，連作顯著驅(qū)動(dòng)了西紅花種植土壤中細(xì)菌和真菌微生物群落的變化（細(xì)菌R2=0.73，P=0.001，真菌R2=0.60，P=0.002）。

2.2不同連作年限西紅花種植土壤微生物群落組成分析

細(xì)菌門水平上的豐度分析（圖2a1）表明，不同連作年限土壤中前5位的優(yōu)勢菌門相同，分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸酐菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）。不同連作年限細(xì)菌豐度門水平的差異分析（表3）表明，種植4年的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度低于種植1年、2年和3年；厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）在種植2年、3年和4年的土壤中高于種植1年的土壤。細(xì)菌屬水平的豐度分析（圖2b1和表3）發(fā)現(xiàn)，Gaiella在種植4年的土壤中豐度顯著低于種植1年、2年和3年（Plt;0.05）；芽生球菌屬（Blastococcus）和土壤紅色桿形菌屬（Solirubrobacter）的豐度隨著連作年限的增加呈現(xiàn)降低的趨勢。

真菌群落門水平上的豐度分析（圖2a2）發(fā)現(xiàn)，子囊菌門（Ascomycota）在4個(gè)連作年限中均為第一大菌門（相對(duì)豐度gt;55%）；4個(gè)連作年限真菌門水平上的豐度差異分析（表4）表明，土壤中毛霉菌門（Mucoromycota）的豐度隨著西紅花連作年限的增加而降低；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在連作4年土壤中的豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）。在屬水平上，被孢霉屬（Mortierella）為4個(gè)連作年限土壤中真菌的優(yōu)勢菌屬（圖2b2）；產(chǎn)油菌屬（Solicoccozyma）在連作4年西紅花土壤中的豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）（表4）。以上結(jié)果說明，隨著西紅花種植年限的增加驅(qū)動(dòng)了土壤中微生物群落組成的變化。

2.3不同連作年限西紅花種植土壤細(xì)菌群落的LEfSe分析

對(duì)西紅花不同種植年限土壤微生物群落進(jìn)行LEfSe分析，進(jìn)一步篩選不同種植年限土壤中的生物標(biāo)記物。通過細(xì)菌LEfSe分析共獲得63個(gè)差異群落，其中連作1年、2年、3年、4年分別為11、13、14和25個(gè)差異群落（圖3）。其中，放線菌門（Actinobacteria）、紅色桿菌綱（Rubrobacteria）、紅色桿菌目（Rubrobacterales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、紅色桿菌科（Rubrobacteriaceae）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、芽球菌屬（Blastococcus）等群落在連作1年的土壤中富集。酸微菌綱（Acidimicrobiia）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）、甲基球菌目（Methylococcales）、梭菌目（Clostridiales）、微球菌目（Micrococcales）、微桿菌科（Microbacteriaceae）、間孢囊菌科（Intrasporangiaceae）、壤霉菌屬（Agromyces）等群落在連作2年的土壤中富集。變形菌門（Proteobacteria）、索力氏菌綱（Solibacterales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、褚氏桿菌屬（Chujaibacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）等群落在連作3年的土壤中富集。疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、浮霉菌綱（Planctomycetacia）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、酸桿菌目（Acidobacteriales）、纖線桿菌目（Ktedonobacterales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、芽胞桿菌科（Bacillaceae）等群落在連作4年的土壤中富集。

2.4不同連作年限西紅花種植土壤真菌群落的LEfSe分析

通過真菌LEfSe分析共獲得42個(gè)生物標(biāo)記物，其中連作1年、2年、3年、4年分別為12、7、12和11個(gè)生物標(biāo)記物（圖4）。毛霉門（Mucoromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉綱（Mucoromycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、被孢霉目（Mortierellales）、毛霉菌目（Mucorales）、根霉科（Rhizopodaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、根霉屬（Rhizopusa）、被孢霉屬（Mortierella）在連作1年的土壤中富集。錐毛殼目（Coniochaetales）、錐毛殼科（Coniochaetaceae）等群落在連作2年的土壤中富集。纖毛亞門（Ciliophora）、旋毛綱（Spirotrichea）、酵母菌綱（Saccharomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、散毛目（Sporadotrichida）、雙足囊菌科（Dipodascaceae）、地霉屬（Geotrichum）等群落在連作3年的土壤中富集。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、絲黑粉菌目（Filobasidiales）、盤菌目（Pezizales）、微囊菌目（Microascales）、小囊菌科（Microascaceae）、糞殼菌科（Sordariaceae）、產(chǎn)油菌屬（Solicoccozyma）等群落在連作4年的土壤中富集。

2.5不同連作年限西紅花種植土壤細(xì)菌和真菌群落的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析

細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析（圖5A和表5）表明，細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)直徑、平均路徑長度、中間中心性和度中心性拓?fù)涮卣髦笖?shù)在連續(xù)種植4年的西紅花土壤中高于種植1年、連續(xù)種植2年和連續(xù)種植3年的西紅花土壤；細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的群落數(shù)量隨著連續(xù)種植年限的增加呈現(xiàn)持續(xù)遞減的趨勢；細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)目、邊條數(shù)目和正相關(guān)條數(shù)目在連續(xù)種植4年的西紅花土壤中均低于種植1年、連續(xù)種植2年和連續(xù)種植3年的西紅花土壤。真菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析（圖5B和表5）表明，連續(xù)種植4年的西紅花土壤中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)目高于種植1年、連續(xù)種植2年和連續(xù)種植3年的西紅花土壤；真菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)條數(shù)目，在第1年種植西紅花的土壤中遠(yuǎn)高于連續(xù)種植2年、3年和4年的西紅花土壤；真菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)直徑和平均路徑長度在第1年種植西紅花的土壤中低于連續(xù)種植2年、3年和4年的西紅花土壤。以上結(jié)果表明，西紅花不同連作年限的土壤中細(xì)菌和真菌群落呈現(xiàn)不同的連接模式。

3結(jié)論與討論

土壤微生物多樣性在保持土壤健康和品質(zhì)中起關(guān)鍵作用，同時(shí)可作為土壤健康的一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)^［21］。在該研究中連續(xù)種植3年和4年的西紅花種植土壤中真菌多樣性指數(shù)Shannon、Simpson、Chao和ACE指數(shù)高于連續(xù)種植1年和2年的土壤；隨著連作年限的增加土壤中真菌OTUs的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)增加的趨勢。Dong等^［22］研究表明，藥用植物西洋參隨著連作年限的增加，耕作土壤中的真菌多樣性呈現(xiàn)增加的趨勢。另外，Dong等^［23］研究表明，在三七的連作體系中，土壤微生物中真菌多樣性與三七死苗率密切相關(guān)。該研究土壤中真菌多樣性隨著西紅花連作年限的增加呈現(xiàn)增加的趨勢，說明西紅花連作改變了土壤的微生態(tài)環(huán)境，與西紅花連作障礙的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。

連作體系改變了土壤微生物群落的組成，從而影響土壤的健康和質(zhì)量^［24］。該研究中不同連作年限西紅花種植土壤細(xì)菌群落組成具有明顯差異。放線菌門（Actinobacteria）的豐度隨著種植年限的增加呈現(xiàn)降低的趨勢。芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度在連作4年的土壤中顯著低于連作1年、2年和3年。該研究中隨著連作年限的增加，有益菌放線菌門和芽單胞菌門的豐度呈降低趨勢，推測有益菌豐度的降低，使得土壤抵抗性降低，土壤中病原菌數(shù)量增加，從而造成西紅花連作障礙。

該研究中通過網(wǎng)絡(luò)分析探究不同連作年限西紅花種植土壤中微生物群落的互作模式。細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的某些拓?fù)湫再|(zhì)，例如節(jié)點(diǎn)數(shù)目、邊條數(shù)目、正相關(guān)條數(shù)目、群落數(shù)量等，隨著連作年限增加呈現(xiàn)降低的趨勢。真菌網(wǎng)絡(luò)中的正相關(guān)條數(shù)目在連作2、3、4年的土壤中少于連作1年的土壤，網(wǎng)絡(luò)直徑和平均路徑長度在連作2、3、4年的土壤中大于連作1年的土壤。Lax等^［25］研究表明，土壤微生物中高度的網(wǎng)絡(luò)連接可以啟動(dòng)植物免疫系統(tǒng)，加速激活抵御病原菌。該研究中隨著連作年限的增加，土壤中細(xì)菌和真菌的網(wǎng)絡(luò)連接呈現(xiàn)降低的趨勢，推測隨著西紅花連作年限的增加，土壤中微生物群落間的連接度降低，導(dǎo)致抵抗病原菌的能力降低，從而造成連作障礙的原因之一。

該研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析西紅花不同連作年限土壤中細(xì)菌和真菌微生物群落的多樣性、組成以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異，從土壤微生物的角度，為西紅花連作障礙的機(jī)制及問題的解決提供理論依據(jù)。

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