摘 要：研究了炮制對(duì)卷柏生物活性成分含量及其體外抗氧化活性及止血作用的影響．結(jié)果表明：隨著炮制溫度逐漸升高和時(shí)間的增加，生卷柏原藥樣中的化合物組分會(huì)發(fā)生熱降解或熱分解，穗花雙黃酮含量降低，總黃酮含量下降，總酚和鞣質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)．生品卷柏被炮制為炭品后，部分色譜峰消失，其中卷柏炒炭藥樣中11個(gè)共有峰的總面積僅為生品卷柏的5.30%；從生品到炭品，其抗氧化能力降低了55.58%；但炒炭卷柏藥樣的止血能力較生品增強(qiáng)，體現(xiàn)了中藥“炒炭存性”的炮制原則．

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；卷柏；炮制；抗氧化活性；止血作用

中圖分類號(hào)：R 945" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" 文章編號(hào)：1007-6883（2024）06-0052-08

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2024.06.008

卷柏Selaginella tamariscina（Beauv．）Spring，是卷柏科（Selaginellaceae），卷柏屬（Selaginella）土生或石生復(fù)蘇植物，又名九死還魂草、回陽(yáng)草．全草入藥，味辛、澀，性平［1］．卷柏為2020年版《中國(guó)藥典》收載的常用中藥，有清熱利尿、破血散瘀、活血止血等功效［2］．且適用于治療急性傳染性肝炎、胸脅腰部的挫傷和全身浮腫等癥，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域、長(zhǎng)江以南各省及陜西南部、甘肅、臺(tái)灣等地［3］．卷柏屬植物的化學(xué)成分比較復(fù)雜，目前己從該屬植物中分離得到黃酮類［4］、炔酚類［5］、苯丙素類和有機(jī)酸類［6］等化合物．其中以穗花杉雙黃酮（Amentoflavone）為代表的雙黃酮類成分最為廣泛［7］，該類成分含量較大，種類繁多，是卷柏屬植物最主要的活性成分之一［8-9］．現(xiàn)代藥理及臨床研究表明卷柏有防癌治癌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓、降血糖和增強(qiáng)人體免疫功能等作用［9］．

卷柏生用可以破血，炒炭后可化瘀止血，常用于吐血、崩漏、便血和脫肛等癥［10］．《證類本草》云：“生用破血，炙用止血”．表明了卷柏經(jīng)過(guò)炮制之后，其藥性發(fā)生了明顯的變化．炮制作為中醫(yī)藥獨(dú)有的制藥技術(shù)，主要為了緩和或改變藥性，使活性成分含量增加，毒性成分含量減少，降低或去除毒副作用及增強(qiáng)藥效［11］．常見(jiàn)的炒法炮制是直接將生藥置于一定溫度的鍋中加熱炒制為表面呈黃色（炒黃品）、或焦褐色（炒焦品）、或焦黑色（炒炭品）［12］．炒制過(guò)程中藥材由于受到溫度、水分和空氣氧等因素的影響，常伴隨著其中諸多有效化學(xué)成分的變化．李根林［13］及吳彩霞［14］等分別比較了生卷柏與卷柏炭的總黃酮及其雙黃酮的含量，楊瑞芳等［15］比較了卷柏炒炭前后的止血作用．炮制程度（炒黃、炒焦和炒炭）對(duì)卷柏的化學(xué)成分及其生物活性的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道．本文以生卷柏為原藥，經(jīng)過(guò)不同程度的炮制，制備炒黃卷柏、炒焦卷柏和炒碳卷柏，利用HPLC法和亮度法測(cè)定了炮制對(duì)其指紋圖譜及穗花杉雙黃酮、總黃酮、總酚和鞣質(zhì)含量的影響，并對(duì)其體外抗氧化和止血作用進(jìn)行了研究，以期為卷柏炮制的深入研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中藥卷柏、云南白藥：購(gòu)于市區(qū)中藥店．新鮮牛血：在當(dāng)?shù)匦竽镣涝讏?chǎng)并于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日獲?。?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙醚、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鈉、蘆丁、無(wú)水乙醇、95%乙醇、干酪素、單寧酸、硝酸鋁、磷酸、福林酚、DPPH、硫酸亞鐵和過(guò)氧化氫等試劑均為AR級(jí)，乙腈為色譜純（廣州化學(xué)試劑公司），穗花杉雙黃酮和芹菜素為色譜純（上海阿拉丁試劑有限公司）．

1.3 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；T6新悅可見(jiàn)分光亮度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XZL-01炒鍋（星知鷺有限公司）；YK-12中藥粉碎機(jī)（山東省青州益康中藥機(jī)械有限公司）；JP-060超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；H1B50R離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；1100-AB 4000液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）．

1.4 方法

1.4.1卷柏炮制

生卷柏：取干燥后的卷柏藥材，剪成小段，去除根與雜物，粉粹并過(guò)40目篩，為生卷柏供試樣品．炒黃卷柏：取去根后凈生卷柏段，置于鍋內(nèi)用文火炒至表面為淡黃色，取出，自然冷卻至室溫．焦卷柏：取上述凈生卷柏段，用文火炒至表面焦黃色，取出，自然冷卻后干燥保存．卷柏炭：取上述凈生卷柏段，用中火炒至表面焦黑色，取出，自然冷卻后干燥保存．

1.4.2 卷柏及其炮制品的HPLC指紋圖譜研究

1.4.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量的穗花杉雙黃酮對(duì)照品，加甲醇制成標(biāo)品樣液，1 mL樣液約含0.5 mg穗花杉雙黃酮，備用．

1.4.2.2 供試品溶液的制備

分別取生卷柏、炒黃卷柏、焦卷柏和卷柏炭四種供試樣品粉末各2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇25 mL，超聲提取120 min，濾過(guò)，回收溶劑．加甲醇定容在50 mL容量瓶．用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，對(duì)每個(gè)待測(cè)供試品，同法制備平行樣液三份，備用．

1.4.2.3 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），色譜梯度洗脫條件如表1所示．進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，柱溫為室溫．

1.4.3 供試品中總黃酮的測(cè)定

卷柏及其炮制品分別用85%（V/V）甲醇制備待測(cè)樣液，并參考賀鋒嘎等［16］的方法測(cè)定總黃酮．

1.4.4 供試品中總酚與鞣質(zhì)含量的測(cè)定

卷柏及其炮制品分別用70%（V/V）乙醇制備待測(cè)樣液，并參考高麥瑞等［17］福林酚法及張宇喆等［18］的方法分別測(cè)定總酚與鞣質(zhì)含量，并按照下列公式計(jì)算：鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量．

1.4.5 供試品體外抗氧化活性測(cè)定

分別將生卷柏、黃卷柏、焦卷柏和炭卷柏過(guò)60目篩備用，分別取2.0 g生卷柏粉末及其三種炮制品粉末用20 mL 70%的乙醇溶解后，放入超聲波清洗器中，功率為100 Hz，以超聲波法提升黃酮的提取效果，溫度設(shè)置為60 ℃，時(shí)間120 min．抽濾得到澄清的提取液．DPPH自由基清除率參考張浩等［19］和趙立春等［20］的方法進(jìn)行．

精密稱取DPPH粉末2.0 mg，配置成60 μmol/L DPPH溶液．分別精密移取生卷柏樣品和炮制樣品的提取液各0.1 mL，分別加入60 μmol/L的DPPH溶液2 mL，混勻后室溫放置3 min，以70%乙醇為空白試劑調(diào)零點(diǎn)，取樣品溶液在517 nm處測(cè)吸光度為[A1]；取樣品溶液0.1 mL加2 mL溶劑，混勻后測(cè)定吸光度為[A2]；取樣品溶液0.1 mL加2 mL DPPH溶液，混勻后測(cè)定吸光度為[A3]．按下述公式計(jì)算：DPPH自由基清除率（%）=[[1-（A1-A2/A3]×100]，其中[A1]為樣品對(duì)DPPH作用后的吸亮度，[A2]為樣品自身對(duì)吸亮度的貢獻(xiàn)，[A3]為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸亮度．

1.4.6 供試品的體外止血作用

1.4.6.1 中藥水提物的制備

采用內(nèi)部沸騰法制備水提物［21］．各稱取5.0 g樣品粉末用24 mL 70%乙醇溶液濕潤(rùn)均勻，加蓋靜置30 min后迅速加入100 mL沸騰蒸餾水，水浴提取1 min，過(guò)濾；第二次提取物料為第一次提取所得濾渣，用同上體積的沸騰蒸餾水水浴提取5 min，最后減壓抽濾并合并濾液，每個(gè)樣品藥液含原藥材為0.03 g/mL；云南白藥處理同上．

1.4.6.2 玻片法測(cè)凝血時(shí)間

滴牛血于清潔培養(yǎng)皿上，血滴直徑為5～10 mm．隨機(jī)分成3組，每組8份．分別加入卷柏的生品及其炮制品的和云南白藥水提物、生理鹽水，用秒表準(zhǔn)確記錄凝血時(shí)間．期間用干燥針頭挑動(dòng)血液觀察凝血情況，直至能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時(shí)間，計(jì)算凝血時(shí)間縮短率［22］．

止血時(shí)間縮短率（%）=（空白組凝血時(shí)間-給藥組凝血時(shí)間）/空白組凝血時(shí)間[×]100．

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)指標(biāo)平行測(cè)定3次．實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，指標(biāo)值測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示．

2 結(jié)果與分析

2.1 炮制對(duì)卷柏提取物的HPLC指紋圖譜的影響

通過(guò)穗花雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、生卷柏、炒黃卷柏、焦卷柏和卷柏炭甲醇提取液的HPLC指紋圖譜分析．四種卷柏樣液的指紋圖譜有11個(gè)共有峰，其中7號(hào)峰對(duì)應(yīng)的是標(biāo)準(zhǔn)品穗花雙黃酮．卷柏及其炒制品甲醇提取液指紋圖譜共有峰及其峰面積見(jiàn)表2．

由表2可知，從生卷柏?炒黃卷柏?焦卷柏?卷柏炭，隨著炮制程度加深，共有峰1、2、7、8、10和11號(hào)的峰面積均逐漸降低（其中8和11號(hào)峰面積均顯示“降?降?消失”），而且在生卷柏中占共有峰總面積的90%以上；3號(hào)共有峰面積顯示“升?降?升”、4號(hào)共有峰面積為“降?升?升”、5和6號(hào)共有峰面積為“升?升?降”、9號(hào)共有峰面積為“升?升（峰值）?消失”．

2.2 炮制對(duì)卷柏總黃酮含量的影響

不同炮制品卷柏的HPLC指紋圖譜中7號(hào)峰為穗花杉雙黃酮，其峰面積在生卷柏中占60%以上，表明穗花雙黃酮是卷柏中主要化學(xué)成分．卷柏黃酮有穗花杉雙黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚、木犀草素和芹菜素及糖苷等化合物．炮制對(duì)卷柏中總黃酮含量的影響見(jiàn)圖1．炒黃卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏中總黃酮含量較生卷柏分別減少了14.34%、8.61%和62.13%．由此可知，隨著炮制程度的加大，樣液中總黃酮的變化呈現(xiàn)波動(dòng)下降趨勢(shì)．

2.3 炮制對(duì)卷柏總酚的含量的影響

炮制對(duì)卷柏中總酚含量的影響見(jiàn)圖2．生卷柏、炒黃卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏的提取液中的總酚濃度為0.159 mg/mL、0.163 mg/mL、0.268 mg/mL和0.160 mg/mL．在一定的溫度和時(shí)間下，卷柏炮制品的總酚含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，而炒焦卷柏的總酚含量最高．

2.4 炮制對(duì)卷柏中鞣質(zhì)含量的影響

炮制對(duì)卷柏中鞣質(zhì)含量的影響如圖3所示．三種炮制品——炒黃卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏的鞣質(zhì)的含量比生品分別增加了10.00%、90.91%和57.14%，炭卷柏的鞣質(zhì)比焦卷柏低，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［23］．

2.5 體外止血實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

不同炮制卷柏樣品對(duì)體外牛血的凝血時(shí)間的影響見(jiàn)表3．體外凝血作用數(shù)據(jù)分析表明：生卷柏與炒黃卷柏及炒焦卷柏的體外凝血作用的差異性不顯著，與炒炭藥樣的差異性顯著，表明了碳品的止血能力比相應(yīng)的生品及炒黃和炒焦卷柏均強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道［10，24］結(jié)果一致．

2.6 炮制對(duì)卷柏抗氧化活性影響

炮制對(duì)卷柏中提取物的自由基清除能力的影響見(jiàn)圖4．生卷柏、炒黃卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏提取物的自由基清除率分別為24.403%、24.521%、25.052%和10.841%．適當(dāng)炮制，其藥物的抗氧化活性略有增加，但差異性不顯著；但炮制成碳品后，其抗氧化活性會(huì)大大降低．隨著炮制程度的加大，其藥樣的體外止血作用出現(xiàn)逐漸的增強(qiáng)，而且卷柏炭平均凝血時(shí)間與生卷柏、炒黃卷柏和炒焦卷柏存在顯著性差異．

炮制后卷柏各種活性物質(zhì)與抗氧化能力之間的相關(guān)性見(jiàn)表4，結(jié)果表明抗氧化活性與其所含的總黃酮、總酚和鞣質(zhì)均具有正相關(guān)性；其中DPPH自由基清除能力與鞣質(zhì)含量及總酚含量呈弱相關(guān)，而與總黃酮?jiǎng)t為極強(qiáng)相關(guān)．

3 討論

炒制是中藥炮制的常用方法之一，因?yàn)槠渑谥品椒ê?jiǎn)單得以廣泛應(yīng)用．卷柏在炒黃、炒焦和炒炭三種炮制操作中，不需添加任何輔料，直接將卷柏生品置鍋中加熱炒至適宜程度．隨著炮制的火候（溫度）逐漸升高和時(shí)間延長(zhǎng)，生品卷柏中的化學(xué)成分產(chǎn)生許多的化學(xué)變化，導(dǎo)致穗花雙黃酮含量降低、總黃酮含量呈下降趨勢(shì)、總酚和鞣質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，這種內(nèi)含物的變化，使得炒炭卷柏抗氧化作用與其它三種產(chǎn)生了顯著的差異性，也體現(xiàn)了中藥炮制過(guò)程的“炒炭存性”［25］，亦驗(yàn)證了唐氏《血證論》中“血之為物，熱則行，冷則凝，見(jiàn)黑則止，遇寒亦止”．古人認(rèn)為紅屬火、黑屬水，五行相克規(guī)律中“水克火”即“黑克紅”，因此有“以黑勝紅”“紅見(jiàn)黑則止”的論述［26］，有認(rèn)為“燒灰諸黑藥皆能止血”［27］．因此傳統(tǒng)中醫(yī)以黑色之品治嘔血、吐血、咯血、漱血，充分體現(xiàn)了中醫(yī)的五行中以水克火之功．臨床也多將藥物燒炭（如血余炭、大薊炭、小薊炭等）之后入藥，以求止血之功［28］．

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為多數(shù)止血藥通常是多途徑發(fā)揮止血效果，如收縮血管，降低毛細(xì)血管通透性，激活凝血因子，促進(jìn)血小板生成、黏附、聚集，抗纖維蛋白溶解等使凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、出血時(shí)間縮短等［29-30］．故可以推斷：卷柏炒炭后，其凝血作用的增強(qiáng)與鞣質(zhì)含量的增多相關(guān)．鞣質(zhì)在內(nèi)服或外用時(shí)，具有止血和收斂作用，并能收縮微血管［30］．其特性是易和蛋白質(zhì)結(jié)合形成大分子物質(zhì)，在血管破損的地方形成硬塊，阻止血液外流，達(dá)到止血的目的［31］．據(jù)文獻(xiàn)［32-35］報(bào)道黃酮類化合物（蘆丁、槲皮素）炒炭后可轉(zhuǎn)化為具有止血作用的鞣質(zhì)，使鞣質(zhì)含量增加，止血作用增強(qiáng)．劉鳳鳴［36］等的藥理研究表明，黃酮類化合物具有改善微循環(huán)，提高體內(nèi)cAMP水平，防治冠心病、高脂血癥和心肌梗塞等作用，是抗血小板聚集的主要有效成分之．卷柏炒炭后，具活血化瘀作用的有效成分總黃酮含量減少，則止血作用可相對(duì)增加，驗(yàn)證了中藥卷柏“生則能行，熟則能止”的論述．此外，炒制高溫下草酸鈣晶體轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x鈣離子、及其碳素等因素密切相關(guān)［31］，而鈣離子也是凝血因子Ⅳ，不僅參與血液凝固的多個(gè)環(huán)節(jié)，其濃度還影響著血小板的活化血小板活化后在損傷部位形成閉塞性聚集體，從而使血管破裂導(dǎo)致的出血自發(fā)停止［37］．而碳素為疏松多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，具有物理性吸附的作用，與血液接觸之后能夠激活其中的凝血因子，使血小板裂解并釋放血小板因子，從而促進(jìn)血液凝固［31，38］．卷柏炭藥的凝血與其鈣離子和碳素的關(guān)系有待進(jìn)一步研究．

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The Effects of Processing on the Active Components

and In Vitro Antioxidant Activity and Hemostasis

of Selaginella tamariscina

GUO Shou-jun，YANG Dong-juan，CHEN Zi-ruo，LING Ya， GUO Ying-ying，

YANG Yong-li*

（College of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normal University， Chaozhou， Guangdong， 521041）

Abstract：The effects of processing on the content of bioactive components and in vitro antioxidant activity and hemostasis of Selaginella tamariscina were studied．The result showed that as the processing temperature gradually rose and the time increased，the compound components in the raw sample of Selaginella tamariscina would undergo thermal degradation or thermal decomposition，the content of amentoflavone decreased，the total flavonoid content decreased，and the content of total phenols and tannins showed an upward trend．After being processed into charcoal，some chromatographic peaks disappeared，and the total area of 11 common peaks in the roasted charcoal sample of Selaginella tamariscina was only 5.30% of that of raw Selaginella．From the raw product to the charcoal product，its antioxidant capacity decreased by 55.58%．However，the hemostatic ability of the roasted charcoal sample is enhanced compared to the raw product，reflecting the processing principle of the traditional Chinese medicine’s“preservation of roasted charcoal”．

Key words：HPLC；Selaginella tamariscina；processing；antioxidant activity；hemostasis

責(zé)任編輯 周春娟