摘 要： 細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2 （suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）在動物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，如細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期、腫瘤和炎癥反應(yīng)等。本研究在首次克隆山羊SOCS2基因的基礎(chǔ)上，研究過表達和干擾SOCS2表達對山羊鼻甲骨細胞增殖、周期及凋亡的影響。以1周歲的健康簡州大耳羊（6只）的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、大腸、小腸和山羊鼻甲骨細胞共9個樣本為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆山羊SOCS2基因CDS區(qū)序列，并進行序列分析。利用RT-qPCR技術(shù)檢測SOCS2基因在不同組織中的表達。將克隆得到的SOCS2基因CDS區(qū)連接載體構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-SOCS2。根據(jù)山羊SOCS2基因序列設(shè)計合成并篩選有效siRNA。利用LipofectamineTM 3000試劑將pcDNA3.1-SOCS2和siRNA片段分別轉(zhuǎn)染至鼻甲骨細胞，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測 SOCS2蛋白表達，MTT法檢測SOCS2對細胞增殖的影響，流式細胞術(shù)檢測SOCS2對細胞周期和凋亡的影響，并利用RT-qPCR技術(shù)檢測細胞周期相關(guān)基因p21、CDK2和凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase7、PARP1、p53、Bax、BCL2L11 和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，成功擴增山羊SOCS2 基因序列，總長為1 065 bp，CDS 區(qū)長為597 bp，編碼198 個氨基酸殘基。SOCS2基因在肝中表達水平最高；SOCS2可以抑制細胞增殖。成功構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-SOCS2，且該基因在鼻甲骨細胞內(nèi)成功表達。SOCS2過表達可導(dǎo)致G2/M+S期細胞數(shù)量顯著增加，且下調(diào)CDK2和p21基因的mRNA表達；促進細胞凋亡，且上調(diào)Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11、Bcl-2 基因的mRNA表達，PARP1表達水平無顯著變化。而干擾SOCS2表達后，G0/G1 期細胞數(shù)量顯著升高，且CDK2和p21基因的mRNA表達上調(diào)；細胞凋亡被抑制，且Caspase3、Bax、p53、PARP1基因的mRNA表達下調(diào)，Caspase7、BCL2L11、Bcl-2基因表達水平無顯著變化。綜上所述，SOCS2可將細胞周期阻滯在G2/M+S期，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。研究結(jié)果為全面揭示山羊SOCS2功能提供試驗數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 山羊；SOCS2；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

中圖分類號：S852.21

文獻標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2226-15

收稿日期：2023-08-28

基金項目：西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目（YB2023338）；四川省科技計劃項目（2023YFN0043）；四川省自然科學(xué)基金項目（2022NSFSC0082）；四川省科技計劃項目（23ZDYF3070）；四川省畜禽育種攻關(guān)項目（2021YFYZ0003）；浙江省科技計劃項目（2022C04017）

作者簡介：李秋云（2000-），女，四川自貢人，碩士，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：428403258@qq.com

*通信作者：向 華，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：xianghua2008411@163.com；朱江江，主要從事畜禽傳染病研究，E-mail：zhujiang4656@hotmail.com

Effects of SOCS2 on Proliferation， Cycle and Apoptosis of Turbinate Bone Cells in Goats

LI" Qiuyun1， TIAN" Xinyuan1， LIAO" Wensheng1， ZHANG" Huanrong1， REN" Yupeng1， YANG" Falong

1， ZHU" Jiangjiang2*， XIANG" Hua1*

（1.Key Laboratory of Animal Medicine at Southwest Minzu University of Sichuan Province，

Chengdu

610041，" China;

2.Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource

Reservation and Utilization

Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 610041，" China）

Abstract：" Suppressor of cytokine signaling 2 （SOCS2） is involved in regulating various physiological and pathological processes in animals， such as cell apoptosis， proliferation， cell cycle， tumor， and inflammatory response. In this study， based on the first cloned SOCS2 gene from goats， the effects of overexpression and interference SOCS2 expression on proliferation， cycle and apoptosis of goat turbinate bone cells were studied. A total of 9 samples of heart， liver， spleen， lung， kidney， rumen， large intestine， small intestine and goat turbinate bone cells of healthy Jianzhou goats （6 animals） were used as samples， and the sequence of the CDS region of the goat SOCS2 gene was cloned by reverse transcription PCR and analyzed the sequence. RT-qPCR was used to detect the expression of SOCS2 gene in different tissues. The cloned SOCS2 gene CDS region ligation vector was constructed as a eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2. Design， synthesis and screen effective siRNAs based on goat SOCS2 gene sequences. After transfecting pcDNA3.1-SOCS2 and siRNAs to turbinate osteocytes with LipofectamineTM 3000 reagent， SOCS2 protein expression was detected with Western blot mothed， the MTT method detects the effect of SOCS2 on cell proliferation， flow cytometry to detect the effect of SOCS2 on cell cycle and apoptosis and RT-qPCR was used to detect the transcription levels of cell cycle-related genes p21， CDK2 and apoptosis-related genes Caspase3， Caspase7， PARP1， p53， Bax， BCL2L11 and Bcl-2. The results showed that the total length of goat SOCS2 gene was 1 065 bp， and the CDS zone length was 597 bp， encoding 198 amino acid residues. SOCS2 gene is expressed at the highest levels in the liver tissue; SOCS2 can inhibit cell proliferation. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2 was successfully constructed， and the gene was successfully expressed in turbinate bone cells. SOCS2 overexpression can lead to a significant increase in the number of cells in the G2/M+S phase and down-regulation of mRNA expression in CDK2 and p21 genes. It promoted apoptosis and upregulated the mRNA expression of Caspase3， Caspase7， Bax， p53， BCL2L11， and Bcl-2 genes， but there was no significant change in PARP1 expression level. However， after interference the expression of SOCS2， the number of cells in G0/G1 stage increased significantly， and the mRNA expression of CDK2 and p21 genes was upregulated. The apoptosis was inhibited and the mRNA expression of Caspase3， Bax， p53 and PARP1 genes was downregulated， while the expression levels of Caspase7， BCL2L11 and Bcl-2 did not change significantly. In summary， SOCS2 can block cells in the G2/M+S phase， promote apoptosis， and inhibit cell proliferation. The results of this study accumulate experimental data for a comprehensive reveal of the function of goat SOCS2.

Key words： goat; SOCS2; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

*Corresponding authors：" XIANG Hua， E-mail：xianghua2008411@163.com; ZHU Jiangjiang， E-mail：zhujiang4656@hotmail.com

細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是一類由細胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的免疫調(diào)控因子［1］。SOCS家族作為炎癥因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的負反饋調(diào)節(jié)因子，可通過抑制炎癥相關(guān)信號通路的核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的過度激活而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)促炎細胞因子的過量釋放，進而抑制炎癥反應(yīng)［2-3］。

同時，SOCS蛋白對先天性免疫和適應(yīng)性免疫起著重要的生理調(diào)節(jié)作用［4］。SOCS2作為SOCS家族中的成員，該基因在部分動物中，可參與調(diào)節(jié)多種細胞因子依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白（janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）的信號通路［5］；進而調(diào)控機體的生理和病理過程，包括細胞凋亡［6］、細胞增殖［7］、細胞周期［8］、腫瘤［9］和炎癥反應(yīng)［10］等。在代謝方面，研究發(fā)現(xiàn)在脂肪肝組織和正常肝組織中，SOCS2的表達模式存在差異［11］。在豬脂肪原代細胞中過表達SOCS2基因能夠抑制生長激素（growth hormone，GH）誘導(dǎo)的脂解作用［12］。在腫瘤方面，大量的研究表明，SOCS2基因的表達水平變化與腫瘤的發(fā)生有顯著相關(guān)性［13-14］。在肝癌患者中發(fā)現(xiàn)其癌組織中SOCS2表達水平顯著下降，且SOCS2基因表達下降的肝癌患者的無病生存期顯著縮短，前列腺癌患者組織中SOCS2表達水平顯著上調(diào)［15］。而且，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）外泌體可以通過SOCS2和JAK3/STAT761信號通路激活成纖維細胞（fibroblasts，NFs），從而影響腫瘤微環(huán)境［16］。在免疫方面，有研究發(fā)現(xiàn)SOCS2基因可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎性細胞因子的水平，說明SOCS2有可能與炎癥反應(yīng)和炎性因子轉(zhuǎn)錄有關(guān)，從而減少炎性細胞的數(shù)目［17］。

同時，SOCS被認為是STATs的靶基因，可以直接作用于JAK/STAT信號通路抑制STATs活化，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程［18-19］。解云菲［20］研究發(fā)現(xiàn)，SOCS3可以通過調(diào)控STAT3 蛋白磷酸化激活 JAK2/STAT3 通路，進而調(diào)節(jié)該通路下游凋亡相關(guān)基因的表達，最終抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的前體脂肪細胞凋亡。Duan等［21］研究發(fā)現(xiàn)，毛花苷C（lanatoside C）可通過調(diào)控JAK2/STAT6/SOCS2信號通路，降低線粒體膜電位來觸發(fā)細胞凋亡，誘導(dǎo)人宮頸癌細胞周期停滯在S期和G2/M期。SOCS2是STAT5a、STAT5b下游靶基因，在催乳素作用下，SOCS2表達顯著升高，繼而調(diào)節(jié)牛乳腺細胞的增殖與泌乳［22］。SOCS2還可以抑制巨噬細胞內(nèi)NF-κB信號通路激活，從而抑制細胞凋亡［23］。然而，對于SOCS2調(diào)控細胞周期及凋亡方面的具體機制尚不清楚，目前，尚無山羊SOCS2基因序列以及其對細胞周期和凋亡調(diào)控作用的研究報道。本研究選用簡州大耳山羊作為材料，采用RT-PCR技術(shù)對山羊SOCS2的基因序列進行了克隆和序列分析；在構(gòu)建 pcDNA3.1-SOCS2真核表達載體的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染山羊鼻甲骨細胞，研究 SOCS2對細胞周期、凋亡、增殖以及周期和凋亡相關(guān)基因的影響；同時干擾SOCS2的表達，探究其對細胞周期、凋亡、增殖及周期和凋亡相關(guān)基因表達的影響，為進一步全面揭示SOCS2功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集、總RNA提取及細胞

本試驗在2022年于西南民族大學(xué)完成。6只1周歲健康簡州大耳山羊購于四川簡陽大哥大牧業(yè)有限公司。將山羊空腹屠宰后，采集每只山羊心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、大腸和小腸組織8個組織樣本，然后用無菌DEPC水沖洗干凈，用錫箔紙包好后快速放入液氮保存待用。采用Trizol法進行組織和山羊鼻甲骨細胞總RNA的提取，質(zhì)量檢測合格后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。山羊鼻甲骨細胞由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室保存。pcDNA3.1（+）真核表達載體由西南民族大學(xué)青藏高原研究院惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

多功能免染蛋白印記系統(tǒng)購自日本Cytiva公司；高速離心機5804購自Eppendorf公司；PCR儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱購自ThermoFisher Scientific公司；凝膠成像儀、半干轉(zhuǎn)移電泳槽購自Tanon公司；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、Premix TaqTM、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購自北京索萊寶公司；Trizol、LipoGeneTM 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自ThermoFisher Science 公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）購自北京全式金公司；細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI Kit 凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物購自美國Millipore公司；鼠 anti-Flag 單抗（sc-166355）、HRP 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG購自Abmart 公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山羊 SOCS2基因克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中山羊SOCS2基因預(yù)測序列（XM_027967202.1）設(shè)計克隆山羊SOCS2的特異性引物（表1）。以山羊肝組織cDNA 為SOCS2 基因PCR擴增模板，并通過 1.5%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測。檢測無誤后膠回收，產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體連接后轉(zhuǎn)化，陽性菌落 PCR 檢測和測序確定無誤后，將重組質(zhì)粒命名為 pMD19-SOCS2。參考王憲軍等［24］方法對山羊SOCS2基因進行序列分析。

1.3.2 真核表達載體 pcDNA3.1-SOCS2 構(gòu)建及siRNA的合成

以SOCS2的CDS區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計亞克隆引物，序列見表 1。上、下游引物劃線部分分別為 BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點，斜體部分為 Kozak 序列，劃線加粗部分為 Flag 標(biāo)簽。使用BamHⅠ和XbaⅠ酶對載體 pcDNA3.1（+）和亞克隆獲得的SOCS2的CDS區(qū)序列進行雙酶切，隨后用 T4 連接酶對回收純化產(chǎn)物進行連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)測序驗證正確后的真核表達載體命名為 pcDNA3.1-SOCS2。使用BamH Ⅰ和XbaⅠ酶對pcDNA3.1-SOCS2質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。將“ 1.3.1 ”克隆獲得的 SOCS2基因的 CDS 區(qū)序列送上海吉瑪基因股份有限公司合成 2 條 siRNA 干擾片段和一條陰性對照序列（表2）。

1.3.3 山羊SOCS2基因的組織表達差異檢測

以“1.1”中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，表1中SOCS2基因克隆引物采用RT-qPCR檢測SOCS2基因在不同組織中的表達差異。以泛素表達轉(zhuǎn)錄因子（ubiquitously-expressed transcript，UXT）基因作為內(nèi)參基因，序列見表1。每個待測樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 山羊鼻甲骨細胞的復(fù)蘇培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

本試驗所用鼻甲骨細胞為實驗室前期分離和純化獲得［25］。復(fù)蘇實驗室凍存的鼻甲骨細胞，即細胞接種于含體積分數(shù)為15% FBS和1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。待第6代細胞生長到70%～80%時，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，操作程序參考文獻［26］。山羊SOCS2過表達組設(shè)置pcDNA3.1-SOCS2組和pcDNA3.1（+）陰性對照組。山羊SOCS2干擾組設(shè)置SOCS2-siRNA1、SOCS2-siRNA2和陰性對照組（Negative control，NC）。轉(zhuǎn)染 48 h 后，提取細胞的總 RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，RT-qPCR 技術(shù)檢測 SOCS2基因的 mRNA 表達水平，篩選出有效的 siRNA 干擾片段。每組試驗設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3次。

1.3.5 檢測SOCS2蛋白在山羊鼻甲骨細胞中的表達

按照“1.3.4”方式進行山羊SOCS2過表達組的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集蛋白樣品。經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上并進行封閉過夜。隨后分別添加鼠源 Flag 單克隆抗體和兔源 β-Actin，4℃孵育過夜。然后再分別添加HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 和山羊抗兔 IgG，室溫搖床孵育 2 h，最后使用 ECL 試劑顯色，成像。

1.3.6 SOCS2對山羊鼻甲骨細胞增殖的影響

參照“1.3.4”方式進行轉(zhuǎn)染，待96 孔培養(yǎng)板內(nèi)細胞生長至70%～80%時，將真核表達載體 pcDNA3.1-SOCS2和 pcDNA3.1（+）分別轉(zhuǎn)染細胞，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h。按照 MTT試劑說明書測定不同時間段562 nm波長處各孔光吸收OD值并繪制細胞生長曲線。同樣，將干擾效率 70%以上的干擾片段和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)24、48、72和96 h，按照類似的步驟檢測干擾SOCS2表達后對細胞增殖的影響。每組設(shè)置5個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

1.3.7 SOCS2對山羊鼻甲骨細胞周期及周期相關(guān)基因表達的影響

參照“1.3.4”方式進行轉(zhuǎn)染，待12孔培養(yǎng)板內(nèi)細胞生長至70%～80% 時，將真核表達載體 pcDNA3.1-SOCS2和 pcDNA3.1（+）分別轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，按細胞周期檢測試劑盒操作步驟收樣，流式細胞儀檢測SOCS2過表達對細胞周期的影響。同樣，將干擾效率 70%以上的干擾片段和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，按照類似的步驟檢測干擾SOCS2表達后對細胞周期的影響。同時以UXT作為內(nèi)參基因，參照王憲軍等［27］設(shè)計的檢測細胞周期相關(guān)基因表達的引物（表1），采用RT-qPCR 測定SOCS2對細胞周期相關(guān)基因mRNA 表達水平的影響。每組設(shè)3 個重復(fù)孔，試驗重復(fù)3 次。

1.3.8 SOCS2 對山羊鼻甲骨細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響

參考“1.3.4”方式進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明書收樣，使用流式細胞儀分別檢測SOCS2過表達和干擾對細胞凋亡的影響。同時，參照但一昕等［28］設(shè)計的檢測細胞凋亡相關(guān)基因的引物 （表1）。以UXT作為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR 測定SOCS2過表達和干擾對細胞凋亡有關(guān)基因 mRNA 表達水平的影響。每組設(shè)3 個重復(fù)孔，試驗重復(fù)3 次。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以UXT為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法對實時熒光定量數(shù)據(jù)進行分析。使用 SPSS20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊SOCS2基因 CDS 區(qū)的克隆及序列分析

膠回收產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化后，經(jīng)測序得到SOCS2基因序列長度為1 065 bp，其中，CDS區(qū)長597 bp，共編碼198個氨基酸（圖1A）。SOCS2 蛋白分子式為C990H1562N270O297S8，分子質(zhì)量為22.258 475 ku，為親水蛋白（圖1B），主要分布在核內(nèi)，不存在信號肽（圖1C），無跨膜區(qū)（圖2A）。SOCS2共有24個磷酸化位點，包括10個蘇氨酸（Thr）、10個絲氨酸（Ser）、4個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點（圖2B）。提交NCBI數(shù)據(jù)庫得到山羊SOCS2基因的GenBank登錄號為MZ_055377。SOCS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占27.78%、52.02%和18.69%（圖2C），SOCS2的三級結(jié)構(gòu)如圖2D。從STRING數(shù)據(jù)庫檢索到與SOCS2蛋白可能存在互作的蛋白包括JAK1、JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1、LCK、GHR、CUL5、TCEB1、TCEB2（圖2E）。系統(tǒng)進化樹顯示，山羊SOCS2基因與綿羊親緣關(guān)系最近，然后是牦牛、牛、豬、人、馬、小鼠，親緣關(guān)系最遠的是大鼠（圖2F）。

2.2 山羊SOCS2基因的組織表達差異分析

由圖3可知，在山羊的心、脾、肝、腎、肺、瘤胃、大腸和小腸8個組織樣本以及鼻甲骨細胞中都能檢測到SOCS2基因的mRNA表達，然而肝中的SOCS2基因mRNA表達水平顯著高于其他組織，其次是大腸，最低的是脾和瘤胃。

2.3 真核表達載體 pcDNA3.1-SOCS2的構(gòu)建及鑒定

對純化后的質(zhì)粒 pcDNA3.1-SOCS2 進行 BamHⅠ和 XbaⅠ雙酶切，得到 5 400 和 600 bp 左右長度片段（圖4A）。測序結(jié)果與預(yù)期相同，表明真核表達載體構(gòu)建成功。

2.4 SOCS2的過表達和干擾效率檢測

以β-Actin為內(nèi)參基因，Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-SOCS2重組質(zhì)粒的細胞中檢測到了標(biāo)簽蛋白Flag的表達（22.258 475 ku），而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）的細胞內(nèi)無 Flag 蛋白的表達，表明SOCS2在鼻甲骨細胞內(nèi)成功表達，可用于該蛋白的功能研究（圖4B）。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，干擾SOCS2（SOCS2-siRNA 1 和SOCS2-siRNA 2）后其相對表達量均顯著低于對照組，其中SOCS2-siRNA2干擾效果最好，可降低SOCS2基因 mRNA 表達水平達 70%，達到了極顯著水平（Plt;0.01） （圖4C），可作為后續(xù)試驗材料。

2.5 SOCS2 對山羊鼻甲骨細胞增殖的影響

試驗結(jié)果見圖5。與對照細胞組相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-SOCS2 組山羊鼻甲骨細胞增殖受到了一定程度的抑制（Plt;0.05），但是隨著時間的延長，其抑制作用減弱。相反，轉(zhuǎn)染 SOCS2-siRNA2促進了山羊鼻甲骨細胞增殖（Plt;0.05），且隨著時間的延長，其促進作用減弱。

2.6 SOCS2 對山羊鼻甲骨細胞周期及周期相關(guān)基因表達的影響

與空載體pcDNA3.1（+）（41.73%±0.40%）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS2組G0/G1期細胞數(shù)（28.54%±0.22%）極顯著降低；而與空載體（48.27%±0.31%）相比較，pcDNA3.1-SOCS2組的G2/M+S期占比約為（61.46%±0.50%），細胞數(shù)上升極顯著（圖6 A）。與陰性對照組（93.61%±0.25%）相比較，轉(zhuǎn)染SOCS2-siRNA2組的 G0/G1 期細胞數(shù)（105.36%±0.14%）顯著增加；而與陰性對照組（10.96%±0.58%）相比較，SOCS2-siRNA2 組G2/M+S 期細胞占比約為（4.63%±0.15%），細胞數(shù)減少極顯著（圖6 B）?？梢姡琒OCS2可以將細胞阻滯于G2/M+S期。周期相關(guān)基因的檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1（+）空載體組相比，pcDNA3.1-SOCS2 轉(zhuǎn)染組CDK2和p21基因的mRNA表達水平下調(diào)（Plt;0.01）（圖6 C）。而與陰性對照組相比，干擾SOCS2表達可上調(diào)CDK2和p21基因的mRNA表達 （Plt;0.01）（圖6 D）。

2.7 SOCS2 對山羊鼻甲骨細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）組的細胞早期凋亡率為9.89%±0.09%、晚期凋亡率為3.90%±0.20%；pcDNA3.1-SOCS2轉(zhuǎn)染組細胞的早期凋亡率為33.77%±0.12%、晚期凋亡率24.34%±0.11%。轉(zhuǎn)染Negative Control 片段組細胞的早期凋亡率為4.34%±0.11%、晚期凋亡率1.62%±0.07%；SOCS2-siRNA2轉(zhuǎn)染組細胞的早期凋亡率為2.24%±0.04%，晚期凋亡率為0.68%±0.06%?？梢?，SOCS2促進了山羊鼻甲骨細胞的凋亡作用（圖7）。細胞凋亡相關(guān)基因檢測結(jié)果顯示，與空載體pcDNA3.1（+）組相比，SOCS2過表達可極顯著上調(diào)細胞內(nèi)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、 p53、BCL2L11 和抗凋亡基因 Bcl-2 mRNA的表達（Plt;0.01），但對PARP1 無顯著作用。敲低 SOCS2 基因表達可極顯著下調(diào)Caspase3、Bax mRNA水平（Plt;0.01），顯著下調(diào)p53 和 PARP1水平（Plt;0.05），對Caspase7、BCL2L11、Bcl-2 mRNA表達無顯著影響（圖8）。

3 討 論

目前，關(guān)于SOCS2功能的研究主要集中于人［29］、牛［30］、鼠［31］等，但尚未有關(guān)SOCS2基因功能的研究報道。同時，山羊鼻甲骨原代細胞常被用于山羊宿主細胞蛋白功能研究以及羊口瘡病毒的增殖和致病機制研究的理想細胞類型之一［25，32-33］。本研究的對象為簡州大耳山羊，通過克隆得到山羊SOCS2基因序列，總長為1 065 bp，CDS 區(qū)長為597 bp，編碼198個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，SOCS2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域且不存在信號肽結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)中以無規(guī)則卷曲最多，其次是α螺旋，推測SOCS2蛋白為非分泌型Mixed樣蛋白且該蛋白可能不在生物膜上行使功能。JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1等蛋白常被報道參與細胞增殖、凋亡及機體炎癥反應(yīng)等。如，馬濤等［34］研究發(fā)現(xiàn)，阿曼托雙黃酮（amentoflavone，AF）可通過抑制SW579細胞中JAK2-STAT3通路活化及其下游基因的表達進而抑制SW579細胞的增殖同時促進細胞凋亡。施姮和舒芳芳［35］研究發(fā)現(xiàn)，干擾SOCS1基因的表達后，連翹苷的作用被抑制，促進了肺泡上皮細胞的凋亡、周期和氧化應(yīng)激。Xiao等［36］研究發(fā)現(xiàn)，過表達RNF7后可以通過泛素化SOCS1激活JAK/STAT3信號通路，從而抑制腎癌細胞的凋亡。結(jié)合本研究互作蛋白的預(yù)測結(jié)果，推斷SOCS2蛋白與這幾種互作蛋白可能存在聯(lián)系，從而一起調(diào)控細胞的凋亡和增殖。

細胞周期的運轉(zhuǎn)受到許多不同種類的蛋白質(zhì)、復(fù)合物以及細胞周期檢測點等復(fù)雜物質(zhì)的參與，這些物質(zhì)之間相互影響、相互作用，共同協(xié)調(diào)和控制著細胞周期的運轉(zhuǎn)，以確保細胞能夠正常地分化、生長和凋亡［37］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞的DNA受到損害時，細胞會利用其周期蛋白協(xié)同調(diào)控細胞周期進程，以便將細胞周期阻滯在某個特定的階段，從而為DNA修復(fù)損傷提供充足的時間［38］。同時，當(dāng)細胞DNA受到輕微損傷時，細胞更容易停滯在G0/G1期，相反則容易停滯在G2/M期，從而有助于細胞的生存［39］。本研究結(jié)果顯示，過表達SOCS2后可將細胞周期阻滯于G2/M+S期，同時下調(diào)p21 mRNA表達抑制細胞的增殖，而干擾SOCS2表達后的結(jié)果相反。由此推測這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是，當(dāng)SOCS2表達發(fā)生變化時影響細胞的增殖以及CDK和p21基因的表達，從而調(diào)控細胞周期進程，為DNA的損傷修復(fù)贏取時間。這相比彭勝建等［40］的研究，更進一步的研究了增殖與周期之間的關(guān)系。除此之外，細胞周期進程還受細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）、p21、內(nèi)源性CDK抑制劑（cycin-dependent kinase inhibitors，CK）的影響［41-43］。細胞周期蛋白K（cyclin K，CCNK）作為細胞周期蛋白家族成員之一，可以調(diào)節(jié)前復(fù)合體的組裝，且表達量與細胞增殖呈正相關(guān)［44］。在本研究中，SOCS2過表達后可抑制細胞的增殖，且下調(diào)CDK的mRNA表達，此結(jié)果與上述報道一致。作者從干擾SOCS2表達后對細胞的影響再次證實上述結(jié)果。

在細胞凋亡信號傳遞過程中，有多種不同的信號傳遞系統(tǒng)參與其中，這些系統(tǒng)會觸發(fā)細胞凋亡程序，其中包括Bcl-2、Casepases、P53、BCL2L11和PARP1等多種蛋白的調(diào)節(jié)［45-46］。這些蛋白中Bcl-2家族（Bcl-2，BCL2L11）又在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，它可以通過降低線粒體釋放的細胞色素C來調(diào)控細胞凋亡的過程［47］。本研究結(jié)果顯示，過表達SOCS2后可促進山羊鼻甲骨細胞的凋亡并上調(diào)細胞內(nèi)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11 mRNA的表達。同時，參考Hirunagi等［48］的方法，設(shè)計、篩選到有效的干擾片段SOCS2-siRNA2，并將其轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)干擾SOCS2表達后可抑制細胞凋亡并且下調(diào)Caspase3、Bax、p53和PARP1 mRNA水平。進而從相反方向證實了SOCS2的功能，這與Li等［23］、Shi等［49］報道的結(jié)果相符合。已有研究顯示，Bcl-2/Bax的比值被認為是調(diào)節(jié)細胞凋亡的開關(guān)，對細胞的存活有很大影響，其比值下降預(yù)示細胞凋亡增加，其比值上升預(yù)示細胞凋亡減少［50］。干擾SOCS2表達后，Bcl-2雖未有明顯變化，但Bcl-2/Bax比值顯著上升，表明細胞凋亡被抑制了。同時，在試驗中發(fā)現(xiàn)，過表達SOCS2基因后，

Bcl-2/Bax比值同樣也出現(xiàn)了上升現(xiàn)象，作者推測在SOCS2基因調(diào)控的細胞凋亡信號通路中，可能還存在其他因子共同參與調(diào)控Bcl-2、Bax基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2過表達可上調(diào)細胞內(nèi)促凋亡基因Caspase7、BCL2L11 mRNA表達，PARP1無顯著變化；而干擾SOCS2表達可下調(diào)PARP1水平，Caspase7、BCL2L11無顯著變化。據(jù)此可以推斷PARP1、Caspase7和Bcl-2家族在表達上可能存在一定的相互作用，但具體作用尚不清楚，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

山羊SOCS2基因總長1 065 bp其CDS區(qū)長597 bp，從ATG開始，到TAA結(jié)束，共編碼198個氨基酸殘基，與綿羊的SOCS2基因同源性最近，與大鼠小鼠同源性最遠，SOCS2在山羊肝中表達最高，脾中表達最低。SOCS2可顯著促進山羊鼻甲骨細胞凋亡，抑制增殖，增加G2/M期和S期細胞數(shù)量。這些結(jié)果為進一步探究山羊SOCS2功能奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）