摘 要： 旨在調(diào)查成都地區(qū)的貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus-1， FHV-1）的流行及遺傳變異情況。試驗選取2020—2023年從成都地區(qū)采集的178份具有呼吸道癥狀貓的眼、鼻及口咽拭子進行FHV-1核酸檢測、gE基因遺傳進化分析、FHV-1的分離鑒定和致病性研究。結果發(fā)現(xiàn)，成都地區(qū)FHV-1陽性率為11.8%（21/178）；其中寵物醫(yī)院FHV-1陽性率為6.4%（7/110），貓舍FHV-1陽性率為20.6%（14/68），表明在貓舍中FHV-1感染率更高。FHV-1 gE基因的遺傳進化分析結果表明，本研究擴增出的5株gE基因和疫苗株的核苷酸同源性在99.1%～100%，并發(fā)現(xiàn)PX-9株存在3個獨特的氨基酸突變位點（L259Q、C294I、W295F）。通過CRFK細胞對5份陽性樣本進行病毒的分離培養(yǎng)，結果PX-9毒株被成功分離鑒定。對PX-9毒株進行動物回歸試驗，結果表明攻毒組貓只表現(xiàn)出眼鼻分泌物增多，打噴嚏等臨床癥狀，在接毒后第4天病毒拷貝數(shù)最高，為9.05×107 copies·μL－1，且排毒期較長；攻毒貓只FHV-1病毒載量檢測結果顯示，氣管及肺組織病毒拷貝數(shù)分別為1.7×107和3.5×104 copies·μg－1，其它組織核酸陰性。綜上表明，在成都地區(qū)仍然存在FHV-1流行，并且流行毒株有較強的致病性。

關鍵詞： FHV-1；流行情況；遺傳變異；動物回歸試驗

中圖分類號：S852.659.1；S858.293

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2253-06

收稿日期：2023-06-15

基金項目：國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系四川獸藥創(chuàng)新團隊（SCCXTD-2020-18）；西南民族大學人才支持基金項目（RQD2021004）

作者簡介：鄧梏男（1996-），男，四川宜賓人，碩士生，主要從事動物疫病防控研究，E-mail：1181389642@qq.com

*通信作者：張 斌，主要從事動物病原分子生物學研究，E-mail：binovy@sina.com；賀 超，主要從事動物疫病防控研究及獸藥監(jiān)察工作，E-mail：525069528@qq.com

Detection of Feline Herpesvirus Type 1 and Pathogenicity of an Isolated Strain

DENG" Gunan1， ZHANG" Jiaqi1， BAO" Zhipeng4， CHEN" Taoyun1， YU" Qisheng1， DING" Lu1， ZHU" Chenxi1， WANG" Yi1， REN" Yupeng1，2， HE" Chao3*， ZHANG" Bin1，2*

（1.College of Animal and Veterinary Sciences， Southwest Minzu University， Chengdu 610041，

China;

2.Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation

and Utilization of Ministry of Education/Sichuan Provine， Chengdu 610041，" China;

3.Sichuan Provincial Veterinary Drug Supervision Institute， Chengdu 610041，" China;

4.Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture， Kunming 650212，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the prevalence and genetic diversity of feline herpesvirus-1 （FHV-1） in Chengdu city. From 2020 to 2023， a total of 178 conjunctiva， pharynx and nose swabs were collected from cats with respiratory symptoms in Chengdu city. The collected samples were subjected to FHV-1 PCR detection， gE gene genetic evolutionary analysis， viral isolation and identification， as well as pathogenicity. The results showed that， the FHV-1 positivity rate in Chengdu city was 11.8% （21/178）. In which the FHV-1 positivity rate of veterinary hospitals was 6.4% （7/110） and 20.6% （14/68） in catteries， suggested that the higher rate of FHV-1 infection was in catteries. The genetic evolutionary analysis of five FHV-1 gE genes showed that the nucleotide homology was 99.1%～100% to the vaccine strains，and three unique amino acid mutation sites were found in PX-9 strain （L259Q， C294I， W295F）. Five positive samples were isolated and cultured by CRFK cell， only PX-9 strain was successfully isolated and identified from CRFK cells. The results of animal regression experiment by PX-9 strain showed that all cats in the infected group exhibited clinical symptoms， such as increased ocular， nasal secretions and sneezing. The highest viral load was found on the 4th day after inoculation （9.05×107 copies·μL－1）， and the detoxification period is relatively long. The results of FHV-1 viral load were 1.7×107 and 3.5×104 copies·μg－1 in trachea and lungs of infected group， respectively. The other tissues were negative for FHV-1 DNA. The results of this study indicated that FHV-1 was still prevalent in Chengdu and the prevalent strains had highly pathogenicity.

Key words： FHV-1; prevalence; genetic variation; animal regression experiment

*Corresponding authors： ZHANG Bin，E-mail：binovy@sina.com; HE Chao， E-mail：525069528@qq.com

貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）是引起貓上呼吸道疾病的主要病原［1］。感染該疾病主要表現(xiàn)為眼鼻分泌物增多、打噴嚏等，呈典型的上呼吸道感染癥狀；有的患貓還會出現(xiàn)舌和硬腭潰瘍、呼吸困難等癥狀［2］。

FHV-1屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬成員。病毒粒子直徑為120～180 nm，呈20面體，由囊膜、核芯、衣殼組成，為線性雙鏈DNA基因組［3］。FHV-1基因組長度約為126～134 kb， G+C含量約為50%，并由獨特長區(qū)（UL）和獨特短區(qū)（US）組成。整個基因組編碼了多種主要的囊膜糖蛋白以及非結構蛋白，其中gE基因位于US區(qū)，屬于結構蛋白，通常被認為是輔助蛋白，但是在自然感染中也是必不可少的［4］。在以前的研究中，F(xiàn)HV-1 gE基因和毒力相關，強弱毒株之間存在gE基因的差異，缺失gE基因會導致FHV-1的病毒毒力降低，但保持有良好的免疫原性［5］。另有研究證據(jù)表明，F(xiàn)HV-1 gE基因具有影響組織趨向、趨化病毒向組織轉移的特性［6］。

本研究采集成都地區(qū)部分寵物醫(yī)院及貓舍中具有呼吸道癥狀貓的眼、鼻及口腔拭子，分析成都地區(qū)FHV-1的流行及gE基因的遺傳變異情況；對分離出的FHV-1毒株進行動物回歸試驗，以期豐富FHV-1的流行病學資料，為防控FHV-1提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

2020—2023年從成都地區(qū)寵物醫(yī)院以及貓舍采集具有呼吸道癥狀（咳嗽、流鼻涕）貓的眼、鼻及口腔拭子樣本，記錄貓的采樣來源、年齡等信息。

1.1.2 細胞與試驗動物

貓腎細胞（crandell reese feline kidney，CRFK）為本實驗室保存；試驗動物為6只8～12周齡田園貓（FHV、FPV、FCV病毒核酸均為陰性）。

1.1.3 主要試劑與儀器

Quick Taq Hs DyeMix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；STE緩沖液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa生物技術有限公司；E. coli DH5α購自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸擴增儀購自杭州博日科技有限公司；電泳儀、紫外凝膠成像分析儀購自上海天能有限公司。

1.1.4 引物

參考文獻［3］及GenBank中FHV-1 gE基因序列設計引物對其進行擴增（登錄號：MH070347.1、MH070347.1），引物序列信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 FHV-1檢測及gE基因的擴增

采用酚-氯仿法提取貓樣本總DNA，使用表1中的引物對樣本的FHV-1進行檢測和gE基因的擴增。

1.2.2 FHV-1 gE基因遺傳進化分析

將本研究獲得的FHV-1 gE基因全長序列與GenBank中已發(fā)表的FHV-1 gE基因利用MEGA7.0序列分析軟件，采用鄰近法（Bootstrap自舉值選擇1 000次）構建系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹。

1.2.3 FHV-1分離培養(yǎng)及純化鑒定

將陽性樣本接種于CRFK細胞，每日觀察細胞病變情況，盲傳三代后利用特異性引物進行PCR檢測；鑒定正確后采用空斑純化方法進行純化，并根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50；同時使用本實驗室保存的兔源FHV-1陽性血清作為一抗進行間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定。

1.2.4 FHV-1動物回歸試驗

將6只8～12周齡的中華田園貓隨機分為2組，每組3只，對攻毒組進行滴鼻500 μL分離純化毒株病毒液（107.2 TCID50·mL－1），對照組接種等量的生理鹽水，隔天采集眼、鼻、口腔拭子保存，攻毒后第9天將對照組貓只安樂死，采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法［7］檢測內(nèi)臟組織中FHV-1的分布并計算病毒拷貝數(shù)，同時運用GraphPad Prism軟件進行分析，Plt;0.05或lt;0.01，則認為數(shù)值差異具有統(tǒng)計學顯著性或高度顯著性。

2 結 果

2.1 PCR檢測結果與分析

對178份成都地區(qū)貓的眼、鼻及口腔拭子進行病毒核酸檢測，結果共檢測出21份FHV-1陽性，陽性率為11.8%（CI=7.5%～17.5%）；寵物醫(yī)院中的陽性率為6.4%（CI=2.6%～12.7%）；貓舍中的陽性率為20.6%（CI=11.7%～32.1%）；幼齡貓（≤6月齡）陽性率為22.2%（CI=10.0%～39.2%），成年貓（＞6月齡）陽性率為11.7%（CI=4.4%～23.9%）；結果顯示FHV-1的感染情況在采樣地點間具有顯著差異（P=0.004），年齡間沒有顯著差異（P=0.195），表明FHV-1在貓舍等貓群聚集的地方傳播性較強，并且FHV-1在成年貓和幼年貓中都會造成感染。

2.2 FHV-1 gE基因的遺傳進化及同源性分析

本文所分離的5株FHV-1 gE基因全長序列（登錄號：OR105893-OR105897）大小為1 599 bp，經(jīng)過序列比對及系統(tǒng)進化樹結果表明其中1株（下文命名為PX-9）gE基因與疫苗株 Companion（GenBank No.KR381803）相比，存在L259Q、C294I和W295F氨基酸位點突變。5株分離株均處于同一分支，其gE基因核苷酸同源性為99.7%～100%，與疫苗株Companion同源性為99.1%～100%。（圖1A）。

2.3 FHV-1的分離培養(yǎng)和鑒定

接種眼、鼻、口腔拭子處理液的CRFK細胞在24 h左右出現(xiàn)細胞聚集、圓縮，成“葡萄串樣”，正常細胞無病變情況，對其空斑純化后進行PCR檢測，結果有單一的目的條帶，IFA結果表明感染FHV-1的CRFK細胞有特異性熒光綠，對照則無（圖1B～圖1F），表明該病毒為FHV-1，并命名為PX-9毒株；采用Reed-Muench法計算其TCID50為107.2 TCID50·mL-1。

2.4 FHV-1致病性試驗

攻毒組貓在第3天開始出現(xiàn)打噴嚏、分泌膿性鼻液（圖2A）等癥狀；第9天將對照組貓安樂死后觀察內(nèi)臟組織病變情況。結果顯示，攻毒組貓肺出現(xiàn)明顯的淤血現(xiàn)象，伴隨出血斑點，對照組貓肺則無病變現(xiàn)象（圖2B～2C）。熒光定量PCR檢測結果顯示，在攻毒組貓的氣管和肺檢出核酸陽性，其病毒拷貝數(shù)分別為1.7×107和3.5×104 copies·μg－1；經(jīng)過GraphPad Prism軟件分析，氣管的病毒載量極顯著高于肺組織的病毒載量（Plt;0.000 1，圖2D），口、鼻、眼拭子樣品經(jīng)檢測，第4天攻毒組貓只的平均病毒載量極顯著高于第2、6和8天攻毒組貓只（Plt;0.000 1、P=0.000 2、Plt;0.000 1），第4天病毒載量最高，為9.05×107 copies·μL－1（圖2E）。

3 討 論

FHV-1是在美國由Crandell和Maurer從患有呼吸道疾病的幼貓中首次分離出來，國內(nèi)則是在2010年首次分離出FHV-1［8］。FHV-1作為引起貓呼吸道疾病的主要傳染病原之一，嚴重威脅著貓的健康，并且貓在隱性感染時和感染康復后都會長期排毒，成為一個潛在的傳染源［9］，且有研究表明，貓在免疫力下降的時候容易造成二次感染［10］。

全球FHV-1的陽性率在7%～63%之間，感染差異較大［11-16］，在我國FHV-1的陽性率為16.3%［17］，本研究中，成都地區(qū)FHV-1的陽性率僅為11.8%，相比我國華東部分地區(qū)的陽性率較低（57.8%）［18］，但是高于我國華南部分地區(qū)FHV-1的陽性率（9.8%）［19］；本研究發(fā)現(xiàn)，貓舍的FHV-1陽性率相比寵物醫(yī)院高，分析由于在寵物醫(yī)院的采樣群體中，較多進行疫苗注射，具有抗體保護，并且寵物貓的生活環(huán)境大多為獨居環(huán)境，感染的幾率較低；而貓舍的貓生活環(huán)境多為群居生活，當健康貓在接觸到被FHV-1污染的飼料、水源、用具及在相互接觸的同時容易被感染［20］，因此檢測出的陽性率較高。

本研究通過CRFK病毒分離及空斑純化，成功分離出1株能穩(wěn)定傳代的FHV-1毒株，命名為PX-9。該毒株與疫苗株Companion相比有3個氨基酸位點的突變，通過動物回歸試驗表明，感染該毒株的貓會出現(xiàn)打噴嚏、眼鼻分泌物增多等情況，這與黃明［21］報道相符合；同時具有較長時間的排毒期［22］，此外PX-9毒株會在呼吸道造成感染，并且具有較強的致病性，可用于當下疫苗保護效果評價以及開發(fā)新疫苗提供備選毒株。

4 結 論

本研究調(diào)查了2020—2023年成都地區(qū)FHV-1的流行率，分析了FHV-1 gE基因的遺傳變異情況，并且成功分離出1株FHV-1毒株，命名為PX-9，進行動物回歸試驗發(fā)現(xiàn)PX-9毒株會造成嚴重的呼吸道感染。

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（編輯 范子娟）