摘 要： 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal tumor，ENT）是山羊的病毒性傳染病，由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV-2）所引起，感染后可以導致山羊的鼻道篩骨上皮細胞發(fā)生不可逆的癌變，已在世界范圍內(nèi)廣泛存在，對山羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。為建立快速、準確且能定量分析ENTV-2的檢測方法，本研究根據(jù)GenBank上發(fā)布的ENTV-2 env基因（MT254061.1）保守區(qū)域設計引物和TaqMan探針，建立ENTV-2 TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法，并對其特異性、靈敏性、重復性與臨床檢測效果進行驗證。結果顯示，重組質(zhì)粒標準品模板濃度為6.30×102～6.30×107 copies·μL-1呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)R2為0.996 5，擴增效率為110%，線性方程的斜率為-2.953，最低檢測限度為6.30×101 copies·μL-1；組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于2%，重復性好；與口蹄疫病毒（（foot-and-mouth disease virus， FMDV）、小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus， PPRV）、藍舌病毒（bluetongue virus）、羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（endogenous retroviruses）等均無交叉反應，表明該方法具有很好的特異性。利用本研究所建立的TaqMan 探針實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法對29份臨床樣品進行檢測，該方法較普通 PCR 方法的檢出率更高。綜上表明，本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan 探針實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法，為ENTV-2的快速診斷和流行病學調(diào)查提供技術手段。

關鍵詞： 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒；羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒；TaqMan；熒光定量RT-PCR

中圖分類號： S858.275.3

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2259-08

收稿日期：2023-07-06

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-39-04B）；白銀市2023年度高層次人才（團隊）引進項目（BYTIP2023-10）；甘肅省科技特派團專項（22CX8NA012）；甘肅農(nóng)業(yè)大學實踐項目（GSAU-JSFW-2023-07）

作者簡介：李鵬飛（1990-），男，甘肅會寧人，博士生，主要從事動物傳染病研究，E-mail： 1054175341@qq.com

*通信作者：袁莉剛，主要從事基礎獸醫(yī)學研究，E-mail：yuan2918@126.com ；尚佑軍，主要從事家畜疫病流行病學與診防技術研究，E-mail： shangyoujun@caas.cn

Establishment and Application of TaqMan Fluorescence Quantitative RT-PCR Detection

Method for Enzootic Nasal Tumor Virus of Goats

LI Pengfei1，2， GAO" Guiqin3， ZHOU "Guangqing2， WU" Jinyan2， YAN" Xinmin2， CAO" Xiaoan2， HE" Jijun2， YUAN" Ligang1*， SHANG" Youjun2*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Veterinary Research

Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China;

3.The Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Team of Baiyin， Baiyin 730900，" China）

Abstract： Enzootic nasal tumor is a viral transmitted infection of goats， which is caused by enzootic nasal tumor virus （ENTV-2） of goats. After infection， it can lead to irreversible canceration of goat nasal meatus ethmoid epithelial cells， which has been widespread in the world， causing serious economic losses to the goat breeding industry. there is an urgent need to establish a fast， accurate， and quantitative detection method for ENTV-2， we designed primers and TaqMan probes based on the conserved region of the ENTV-2 env gene published on GenBank， and developed a TaqMan probe real-time fluorescence quantitative RT-PCR detection method （qRT-PCR） for ENTV-2， and then verified its specificity， sensitivity， reproducibility， and clinical detection effectiveness. The results showed that the concentration of the recombinant plasmid standard template was 6.30×102-6.30×107 copies·μL-1， there is a good linear relationship within the range， with a correlation coefficient of R2 of 0.996 5， amplification efficiency of 110%， slope of the linear equation of -2.953， and minimum detection limit of 6.30×101 copies·μL-1; The intra group and inter group coefficients of variation are both less than 2%， indicating good reproducibility; There was no cross reaction with Foot-and-mouth disease virus （FMDV）， peste des petits ruminants virus （PPRV）， Endogenous retroviruses （ERVs）， etc.， indicating that this method has good specificity. The qRT-PCR established in this study was used to detect 29 clinical samples， and the detection rate of this method is higher than that of ordinary PCR methods. The above results indicate that this study has successfully established a qRT-PCR for ENTV-2， providing a technical means for rapid diagnosis and epidemiological investigation of ENTV-2.

Key words： enzootic nasal tumor virus of goats; endogenous retroviruses; TaqMan; Real-time quantitative RT-PCR

*Corresponding authors：" YUAN Ligang， E-mail： yuan2918@126.com; SHANG Youjun， E-mail： shangyoujun@caas.cn

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal adenocarcinoma，ENA）是由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV-2）引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染?。?］。與綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）［2］、綿羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of sheep，ENTV-1）［3］類似，ENTV-2屬于β反轉(zhuǎn)錄病毒屬，為線性單股正鏈RNA病毒，基因組大小約7 500 bp，其結構類似于真核細胞內(nèi)的 mRNA，5′端為甲基化的帽結構（mGpppGmp），3′端為多聚 A （poly A），基因組的兩端為非編碼區(qū)，中間編碼區(qū)由一個相互重疊的 gag-pro-pol-env 基因組成［3-5］。ENTV-2病毒粒子為圓形，直徑 90～110 nm，最外層是囊膜，其表面附有大量的纖突，纖突的直徑約為 9 nm［1，6］。病羊的腫瘤組織和鼻液中含有大量病毒粒子。研究者已經(jīng)在 ENTV-2 的體外培養(yǎng)方面做了很多探索，但目前為止仍未找到可以穩(wěn)定培養(yǎng)病毒的細胞系或成熟感染性的克?。?］。ENTV-2的env 基因的開放閱讀框始于 pol 基因內(nèi)部，它編碼的多肽前體長約為 617 個氨基酸殘基，預測分子量為68 ku［3，8］。env 的開放閱讀框編碼具有兩個切割位點的多聚蛋白前體，一個蛋白酶切割位點將該基因切割成表面蛋白（surface protein，Su）和跨膜蛋白（transmembrane protein，Tm），另一個位點位于信號肽序列之后，Su 含有與靶細胞的表面受體 Hyal2 結合的位點［9-11］。研究表明env是一個癌基因，但env內(nèi)沒有形成腫瘤的組織特異性因子，其組織嗜性由3′特異元件（unique 3′ region，U3）和env共同決定［12-14］。宿主感染病原后臨床上表現(xiàn)為漿液性鼻液，明顯呼吸困難，消瘦，因腫瘤組織的增生使得山羊面部甚至顱骨變形，眼球突出［15］。該病潛伏期長，自然感染動物的潛伏期從幾個月到2～4年不等，通常以死亡為轉(zhuǎn)歸［16］，發(fā)病初期很難通過臨床癥狀進行判斷，對山羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅。

該病于1939年首次在德國報道，此后在其他國家和地區(qū)相繼被報道。我國于1995年在內(nèi)蒙古首次報道以來，湖南、四川、安徽、陜西、貴州、福建、重慶均有山羊ENA病例［15］。目前，既沒有有效的藥物，也沒有疫苗防治該病，給山羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［17］。因此，建立快速、準確、高效的檢測方法對該病的診斷和防控具有重要意義。

熒光定量PCR作為一種快速、靈敏的診斷方法已被廣泛應用于病原檢測、分子診斷、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面，相比傳統(tǒng)RT-PCR檢測手段具有明顯的優(yōu)勢。本研究基于TaqMan探針的熒光定量RT-PCR方法建立了山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的快速檢測方法，以期為ENTV-2的流行病學調(diào)查與防控提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 臨床樣品

山羊鼻內(nèi)腫瘤組織材料、鼻拭子采自重慶、云南、陜西等地山羊養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑與材料

DL2000 DNA Marker、One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit （Perfect Real Time）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T 載體、大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；2×Pro Taq預混液購自艾科瑞生物；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒陽性核酸由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中公布的ENTV-2 env基因（MT254061.1）保守區(qū)域設計引物（ENTV-2 F：5′-TGGTACGATGAGACTGCCTTAGAG-3′；ENTV-2 R：5′-CACTTTCGTGACATTATATGACAGG-3′）和TaqMan探針（ENTV-2 P：FAM-CCGCAAGGAAAGAAGTGTGAGCCTGATT-BHQ1），引物的特異性目的片段長度為204 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 核酸提取

Trizol 提取法提取病料樣品總RNA，將制備好的核酸樣本保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 質(zhì)粒標準品的構建

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將“1.2.2”中獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以設計的ENTV-2引物對進行 PCR 反應。按試劑盒說明書加入各反應組分并充分混勻，反應程序：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 循環(huán)數(shù)為35；最終72 ℃ 延伸2 min。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性片段經(jīng)膠回收純化后克隆至 pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。擴大培養(yǎng)、提取重組質(zhì)粒，并將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒作為陽性標準品，并用 NanoDrop2000測定重組質(zhì)粒DNA濃度，根據(jù)公式：重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)（copies·μL-1）=重組質(zhì)粒的濃度（g·μL-1）×6.02×1023/345×重組質(zhì)粒的堿基長度，計算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.2.4 反應體系的優(yōu)化

以重組質(zhì)粒為模板，采用矩陣法對熒光定量RT-PCR反應體系中引物和探針的濃度進行優(yōu)化，PCR反應體系中上游引物ENTV-2 F （10 μmoL·L-1）、下游引物ENTV-2 R （10 μmoL·L-1） 加液量分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μL，探針ENTV-2 P （10 μmoL·L-1） 加液量為0.4、0.8、1.2、1.6 μL。反應條件為42℃ 5 min，95℃ 10 s，95℃ 5s，60℃ 20 s，40個循環(huán)，選擇Ct值小且熒光強度大的最佳引物和探針組合作為最優(yōu)反應體系。

1.2.5 熒光定量RT-PCR方法建立

將重組質(zhì)粒標準品進行10倍倍比稀釋，選取濃度為6.30×102～6.30×107 copies·μL-1標準質(zhì)粒建立標準曲線。反應體系為20 μL：包括2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS（5 U·μL-1）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、上下游引物（10 μmoL·L-1）和探針（10 μmoL·L-1）各0.4 μL，質(zhì)粒模板1.0 μL，無RNA酶水7.0 μL。每個稀釋度設3個重復，并設置陰性對照。反應條件為42℃ 5 min，95℃ 10 s，95℃ 5s，60℃ 20 s，40個循環(huán)，在60 ℃處采集熒光信號。

1.2.6 特異性試驗

以健康山羊鼻拭子和腎組織中提取的RNA作為內(nèi)源性鼻內(nèi)腫瘤病毒的陽性樣本，以口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒、藍舌病毒核酸以及內(nèi)源性鼻內(nèi)腫瘤病毒核酸為模板，自然感染ENTV-2重組質(zhì)粒為陽性對照，并設置陰性對照，用所建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法進行檢測，確定其特異性。

1.2.7 靈敏性試驗

選取10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒，濃度為6.30×100～6.30×107 copies·μL-1作為模板，每個濃度重復3次，陰性模板為無RNA酶水，進行熒光定量RT-PCR反應，根據(jù)Ct值和擴增曲線，以確定該方法的最低檢測濃度， 同時用普通PCR 擴增對本方法進行進一步的評估。

1.2.8 重復性試驗

分別以6.30×104、6.30×105、6.30×106 copies·μL-1 3個稀釋度作為模板，進行3次組內(nèi)和組間重復試驗，對Ct值進行分析，用以評價該方法的重復性。

1.2.9 臨床樣本檢測

利用本研究所建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法對29份疑似感染ENTV-2的山羊組織和鼻拭子進行檢測，以自然感染NTV-2山羊鼻拭子中提取的RNA為陽性對照，無RNA酶水為陰性對照，并和普通 PCR 方法進行比較［18］。

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒標準品的制備

將樣品中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，PCR擴增出約204 bp大小的目的片段（圖1A）。切膠回收目的條帶，連接至pMD18-T載體。提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（圖1B）與測序鑒定，表明成功構建出陽性重組質(zhì)粒。測得質(zhì)粒濃度為200 ng·μL-1，換算成拷貝數(shù)約為6.30×1010 copies·μL-1。

2.2 反應體系的優(yōu)化

對引物濃度和探針濃度優(yōu)化后，最終確定的最佳反應體系為20μL，其中2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS（5 U·μL-1）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、上下游引物（10 μmoL·L-1）和探針（10 μmoL·L-1）各0.4 μL，質(zhì)粒模板1.0 μL，無RNA酶水7.0 μL。反應條件為42℃ 5 min，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)，在60 ℃處采集熒光信號。

2.3 標準曲線的構建

測序正確的陽性重組質(zhì)粒，以 6.30×102～6.30×107 copies·μL-1濃度為模板進行熒光定量RT-PCR擴增，并繪制標準曲線。擴增曲線和標準曲線（圖2）顯示，拷貝數(shù)對數(shù)值（x軸）與Ct值（y軸）線性方程為Y=-2.953X+34.651，R2=0.996 5，E=110%，表明建立的方法具有較好的線性關系。

2.4 特異性試驗

分別以口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒、藍舌病毒核酸以及內(nèi)源性鼻內(nèi)腫瘤病毒核酸為模板，自然感染ENTV-2羊鼻拭子中提取的RNA為陽性對照，無RNA酶水為陰性對照，進行熒光定量RT-PCR反應。結果（圖3）顯示，該方法僅對ENTV-2具有特異性，其他病毒基因組和陰性對照均無特異性擴增曲線，表明該方法具有較強的特異性。

2.5 靈敏性試驗

將所構建的重組質(zhì)粒標準品10倍稀釋，以6.30×100～6.30×107 copies·μL-1作為模板，分別用熒光定量PCR和普通PCR進行擴增反應。結果顯示，普通 PCR 的最低檢出限為6.30×103 copies·μL-1，熒光定量RT-PCR對6.30×101 copies·μL-1仍可擴增出特異性曲線（圖4），因此 熒光定量RT-PCR 比普通 PCR 的敏感性高。

2.6 重復性試驗

以濃度分別為6.30×104、6.30×105、6.30×106 copies·μL-1 3個稀釋度的重組質(zhì)粒標準品作為模板進行3次重復性試驗，結果顯示，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)均在2%以內(nèi)。表明建立的熒光定量RT-PCR方法重復性好。

2.7 臨床樣品檢測

應用本試驗所建立的TaqMan熒光定量RT-PCR和普通PCR方法對收集的29份臨床樣品分別進行檢測，結果顯示，本試驗建立的熒光定量RT-PCR檢測到ENTV-2陽性樣品10份，檢出率為34.48%（10/29）；普通PCR檢測到ENTV-2陽性樣品6份，檢出率為20.69%（6/29），二者的符合率為 86.2%。表明本研究所建立的熒光定量RT-PCR檢測方法較普通RT-PCR檢測方法靈敏度更高。

3 討 論

ENT特征是山羊鼻道篩骨上皮細胞發(fā)生腫瘤性轉(zhuǎn)化，該病一年四季均可發(fā)生，多呈散發(fā)，潛伏期長，致死率高，對山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成巨大影響［19］。除了澳大利亞和新西蘭以外，大部分國家均有該病的報道。近年來，我國多地相繼報道了該病的存在，嚴重影響我國山羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［15，20］。由于該病毒無法體外培養(yǎng)且無感染性分子克隆，限制了ENTV-2致瘤分子機理和免疫特性方面的研究［21-22］，目前，針對該病并沒有有效的藥物和疫苗來控制其發(fā)生和流行［23］，羊場一旦出現(xiàn)該病，難以清除，只能淘汰并且會造成長期危害。

因此，通過早期診斷及時淘汰患病羊降低經(jīng)濟損失對ENTV-2的防控具有重要意義。對該病的檢測，常用方法為臨床癥狀結合組織病理學方法，但組織病理學方法取材困難，程序復雜，耗時較長［1，19］。研究者認為ENTV-2感染羊后并不能誘導特異性的免疫應答，或者病毒本身具有免疫抑制性，故血清學診斷方法難以實現(xiàn)［24-26］。

普通PCR靈敏度低，且感染早期患羊體內(nèi)病毒載量可能并不高，容易產(chǎn)生假陰性結果，因此，此方法存在一定的局限性。實時熒光定量RT-PCR檢測方法操作簡單，靈敏度高，特異性好，已廣泛應用于臨床檢測。染料法（SYBR Green）和探針法（TaqMan probe）是熒光定量PCR最常用的。染料法雖然價格低廉且不需要設計探針，但SYBR染料在濃度較高時會抑制PCR的反應，低濃度時不能充分結合DNA鏈，靈敏性沒有探針法高。探針法雖然需要合成昂貴的特異性探針，但其能夠精確地識別模板，比染料法特異性更強，靈敏度更高，并且探針法能夠?qū)Σ≡M行早期診斷。但由于羊源內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（endogenous retroviruses，ERVs）的存在，建立ENTV-2的PCR診斷方法仍存在一定困難［27］。近些年來，隨著全基因序列的測定為建立PCR檢測方法提供了基礎。

本研究根據(jù)GenBank上發(fā)布的ENTV-2 env基因（MT254061.1）保守區(qū)域設計引物和TaqMan探針，建立ENTV-2 TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法。用構建的陽性標準質(zhì)粒進行標準曲線的制備，標準曲線線性關系好，相關系數(shù)R2為0.996 5。建立的ENTV-2熒光定量RT-PCR方法能檢測的最低拷貝數(shù)為6.30×101 copies·μL-1。使用該方法對與其他常見病原及內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒進行檢測，均未擴增出特異性曲線，說明建立的方法對ENTV-2具有較強的特異性。通過對3個不同濃度的質(zhì)粒進行檢測，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)均在2%以內(nèi)，說明該方法具有良好的重復性。應用本研究建立的熒光定量RT-PCR 方法和普通 PCR 方法對29份臨床樣品進行檢測，檢出率分別為 34.48% 和 20.69%，敏感性高于普通PCR方法。本研究建立的 ENTV-2 TaqMan 熒光定量RT-PCR檢測方法可作為山羊ENT的一種有效的臨床診斷工具，為ENTV-2快速診斷和流行病學調(diào)查提供支持。

4 結 論

通過檢測標準質(zhì)粒的各種參數(shù)和臨床樣本，證明本研究建立的ENTV-2的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高、重復性好等優(yōu)點，可以補充現(xiàn)有的ENTV-2檢測技術，為ENTV-2快速診斷和流行病學調(diào)查提供技術支持。

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（編輯 白永平）