摘 要： 目前，多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis， AE）尚無有效藥物治療手段，迫切需要開發(fā)新型治療藥物。前期研究表明，HIV蛋白酶抑制劑（HIV protease inhibitors，HIV PIs）具有潛在抗寄生蟲功能。本文旨在研究HIV PIs對Echinococcus multilocularis （Emu）DNA損傷誘導(dǎo)樣1蛋白（DNA damage inducible 1 protein，Ddi1）活性的影響。本研究通過構(gòu)建真核表達(dá)重組載體pFastBac1-Emu Ddi1，在昆蟲細(xì)胞系Sf9細(xì)胞中表達(dá)篩選出P1代和P2代，純化出可溶性Ddi1重組蛋白，然后與目的蛋白的熒光底物檢測純化蛋白的活性，進(jìn)一步檢測沙奎那韋（saquinavir，SQV）、利托那韋（ritonavir，RTV）、安普那韋（amprenavir，APV）、阿扎那韋（atazanavir，ATV）、洛匹那韋（lopinavir，LPV）、福沙那韋（fosamprenavir，F(xiàn)os）、達(dá)蘆那韋（darunavir，DRV）等7種HIV PIs對Emu Ddi1重組蛋白活性的抑制能力。結(jié)果顯示：細(xì)胞系內(nèi)真核表達(dá)產(chǎn)物的酶活Km為1.422 μmol·L-1，具有良好的親和力和活性，最終篩到沙奎那韋對Ddi1蛋白二聚體活性位點的抑制率達(dá)67%，其IC50為34，說明沙奎那韋對Emu Ddi1重組蛋白酶活性具有良好的抑制效果。以上結(jié)果提示：沙奎那韋抑制重組蛋白Ddi1的活性，可能成為Ddi1的靶向藥物，以期為替代藥物或開發(fā)聯(lián)合用藥提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 蛋白酶抑制劑；多房棘球蚴；DNA損傷誘導(dǎo)樣蛋白；酶活性；抑制率

中圖分類號： S852.734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2273-08

收稿日期：2023-08-03

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD1800205）；甘肅省杰出青年基金（21JR7RA027）

作者簡介：張生英（1994-），女，甘肅天祝人，碩士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學(xué)研究，E-mail： zhangsy1016@126.com

*通信作者：郭愛疆，主要從事人獸共患寄生蟲學(xué)研究，E-mail： guoaijiang@caas.cn；王 帥，主要從事人獸共患寄生蟲免疫學(xué)研究，E-mail：wangshuai@caas.cn

The Effect of Seven Protease Inhibitors on Activity of DNA Damage Inducible 1 Protein

in Echinococcus multilocularis

ZHANG" Shengying， LIU" Zhongli， GUO" Aijiang*， WANG" Shuai*

（State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute，

Lanzhou 730046，nbsp; China）

Abstract： As no effective treatment for alveolar echinococcosis （AE） is currently available， the therapeutic drugs are needed urgently. Early stage studies have shown that the protease inhibitors of HIV could also be anticancer and anti-parasitic. The purpose of this paper is to study the effect of the inhibitors （HIV PIs） on the activity of DNA damage inducible 1 protein of Echinococcus multilocularis （EmuDdi1）. The recombinant vector pFastBac1-EmuDdi1 was constructed and expressed in Sf9 cell， and the soluble protein was successfully purified in P2 generations. Then the enzyme activity of Ddi1 protein was detected with the specific fluorescent substrates， and the inhibition rate of seven HIV PIs including saquinavir （SQV）， ritonavir （RTV）， amprenavir （APV）， atazanavir （ATV）， lopinavir（LPV）， fosamprenavir （Fos）， tipranavir （TPV） and darunavir （DRV） on Ddi1 protein activity was further examined. The results showed that EmuDdi1had high affinity and activity， and saquinavir showed the highest inhibition rate at 67% to inhibit protease activity of EmuDdi1 with a IC50 at 34. These results suggested that saquinavir is effcetive to inhibit the activity of Ddi1， and could be used to develop a potential targeting drug for AE.

Key words： protease inhibitors; Echinococcus multilocularis; DNA damage inducible 1 protein; enzyme activity; inhibition rate

*Corresponding authors：" GUO Aijiang， E-mail： guoaijiang@caas.cn; WANG Shuai， E-mail： wangshuai@caas.cn

棘球蚴病俗稱包蟲病，是由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲-棘球蚴寄生于人和動物的肝、肺等組織器官而引起的一種重要的人畜共患寄生蟲病，對人體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生很大的危害［1］。其中，多房棘球蚴病屬于泡型包蟲?。╝lveolar echinococcosis， AE），其癥狀類似癌癥。在流行病學(xué)中，犬科動物作為最終宿主，各種嚙齒動物作為中間宿主，其復(fù)雜的流行生活史給公共衛(wèi)生帶來重大負(fù)擔(dān)［2］。目前，主要以阿苯達(dá)唑作為治療包蟲病，但其效果并不理想，為此迫切需要研發(fā)新型藥物［3］。

目前，DNA 損傷誘導(dǎo)樣蛋白作為治療疾病的潛在藥物靶點引起了人們的廣泛關(guān)注。DNA損傷誘導(dǎo)樣1蛋白（DNA damage inducible 1 protein，Ddi1）是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，其中心是逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域（RVP）［4］，在所有真核生物中高度保守，與天冬氨酸蛋白酶家族A2同源，由于Ddi1屬于穿梭蛋白家族，可靶向多聚泛素化底物使蛋白酶體水解［5-6］。Ddi1的3D結(jié)構(gòu)與HIV-1蛋白酶（HIV-1 protease，PR）的結(jié)構(gòu)相似，并且表達(dá)天冬氨酸蛋白酶發(fā)揮功能，HIV蛋白酶抑制劑（HIV protease inhibitors，HIV PIs）通過抑制HIV天冬氨酸蛋白酶將前體蛋白切割其活性位點，從而抑制Ddi1的活性，可作為寄生蟲和病毒感染以及癌癥治療和預(yù)防的潛在藥物靶點［7-8］。目前，上市的9種HIV蛋白酶抑制劑是奈非那韋、利托那韋、茚地那韋、安普那韋、洛匹那韋、阿扎那韋、福沙那韋、替普那韋和達(dá)魯那韋，發(fā)現(xiàn)奈非那韋是最有效的，同時對其相互作用的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)92個預(yù)測的細(xì)胞靶標(biāo)，與奈非那韋結(jié)合親和力最強(qiáng)的是天冬氨酸蛋白酶［9］。此外，奈非那韋在抗癌、抗病毒和抗寄生蟲方面也非常有效，是目前預(yù)防和治療相關(guān)疾病的有潛力的小分子藥物［3］。研究報道在蠕蟲全基因組中存在逆轉(zhuǎn)錄病毒樣天冬氨酸蛋白酶基因序列，并證明了奈非那韋藥物抗寄生蟲的機(jī)制與阻斷 EmuDdi1酶活性密切相關(guān)［3］。本研究擬在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)出EmuDdi1蛋白，進(jìn)而通過酶活性分析和小分子藥物抑制力分析，進(jìn)一步篩選靶向抑制寄生蟲蛋白酶活性抑制力效果好的HIV蛋白酶抑制劑，以期成為替代藥物的潛力。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細(xì)胞質(zhì)粒

Sf9昆蟲細(xì)胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DH10bac感受態(tài)細(xì)胞購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、2×PCR Master Mix均購自TaKaRa公司；硫酸卡那霉素、鹽酸四環(huán)素、硫酸慶大霉素購自Aladdin公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白純化填料購自美國GE公司。HRP-Conjugated 6×His，His-Tag單克隆抗體購自北京安諾倫生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；三乙醇胺、利托那韋、沙奎那韋、安普那韋、阿扎那韋、洛匹那韋、福沙那韋、達(dá)蘆那韋均購自Macklin公司；醋酸鈉緩沖液和DMSO購自Sigma公司。

1.2 pFastBac1-Emu Ddi1 重組載體的構(gòu)建

根據(jù)Emu Ddi1基因的ID：（WormBase：EmuJ_000898400.1）下載CDS區(qū)序列，在序列上游插入酶切位點BamHⅠ（GGATCC），其次加入 Kozak序列（GCCGCCACC）和一段分泌信號肽（MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA），中間插入目的基因CDS序列，在其下游插入8 His Tag-Flag （CACCACCATCATCACCATCACCAC），最后插入酶切位點XhoⅠ（CTCGAG），送至西安擎科生物有限公司基因合成。合成后的基因與表達(dá)載體pFastBac1同時用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，雙酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶在16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH10bac感受態(tài)中，無抗LB復(fù)蘇1 h后涂布于抗性的藍(lán)白斑篩選的平板上，其包含50 μg·mL-1卡那霉素、7 μg·mL-1慶大霉素、100 μg·mL-1四環(huán)素、40 μg·mL-1 X-gal 和100 μg·mL-1 IPTG。待24 h后挑取白色菌落于5 mL含有三抗的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 220 r·min-1過夜培養(yǎng)。次日吸取1 mL菌液用天根小提質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取，用M13引物PCR鑒定和雙酶切方法驗證單克隆菌株。所用引物M13 F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13 R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′；PCR反應(yīng)總體系為25 μL：上述提取質(zhì)粒1 μL，2×PCR Master Mix酶12.5 μL，M13F和M13R終濃度為10 μmol·L-1各0.5 μL，其余用無菌水10.5 μL補(bǔ)足。反應(yīng)條件為96 ℃ 3 min；96 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，將雙重驗證為陽性的重組質(zhì)粒送至西安擎科生物有限公司測序，將測序比對結(jié)果一致的作為陽性菌株，將其1∶100比例100 mL LB培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，為下一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及收獲P1代

取2 mL密度為0.5×106 mL-1的Sf9細(xì)胞接種于六孔板中，27 ℃靜置待細(xì)胞貼壁。吸取20 mL擴(kuò)增菌液用無內(nèi)毒素小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，然后將1 μg的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑在1.5 mL無菌離心管中充分混勻后，用培養(yǎng)基補(bǔ)至1 mL混勻，再輕輕加至提前鋪好貼壁的Sf9細(xì)胞中。于27 ℃靜置培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染跡象（4～7 d），將其余培養(yǎng)物離心后轉(zhuǎn)移至無菌2.0 mL EP管中，作為P1代病毒置于4 ℃避光保存。取少量樣品提取總蛋白用Western blot檢測表達(dá)情況，HRP-conjugated 6×His， His-tag單克隆抗體稀釋至1∶1 000室溫孵育90 min，用TPST洗滌30 min，每次10 min，用ECL化學(xué)發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測。

1.4 擴(kuò)增P2代病毒和純化可溶性蛋白

取30 mL密度為2.0×106 mL-1的Sf9細(xì)胞接種至250 mL三角瓶中，再向三角瓶中加入1∶100的P1病毒以擴(kuò)增P2病毒，27 ℃ 120 r·min-1培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)物收集離心后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，取5 mL進(jìn)行Ni柱純化并利用Western blot檢測純化情況，與上述“1.3”中所用試劑和方法一致，其余上清作為P2病毒置于4 ℃避光保存。小量檢測確定表達(dá)后進(jìn)行大量純化，取200 mL密度為2×106 mL-1的Sf9細(xì)胞接種至1 L三角瓶中，再向三角瓶中加入1∶100的P2病毒以擴(kuò)大表達(dá)，27 ℃ 120 r·min-1培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)物離心后取全部上清進(jìn)行Ni柱純化，同時取少量再次利用SDS-PAGE檢測純化蛋白純度，最終將獲取蛋白透析至pH7.4的 PBS中，分裝后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 酶活性檢測

為了確定底物對重組酶活性的最佳蛋白濃度和pH，進(jìn)行篩選重組蛋白工作的濃度和反應(yīng)緩沖液的pH。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對純化的蛋白進(jìn)行定量，將重組蛋白工作終濃度設(shè)定為6、20、50、100、200 μg·mL-1，然后設(shè)置反應(yīng)緩沖液的pH為3、5、7和9，選擇10 mmol·L-1三乙醇胺和100 mmol·L-1 醋酸鈉作為反應(yīng)緩沖液。用合成帶有熒光的底物DABCYL-GABA-SQNYPIVQ-EDANS檢測酶活性，設(shè)計200 μL的反應(yīng)體系：終濃度為100 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液，2 μmol·L-1底物，10 μg·mL-1純化的Ddi1蛋白，PBS為對照，設(shè)置3個重復(fù)孔，在37 ℃靜置孵育2 h后，通過SYNERGY H1酶標(biāo)儀檢測OD340 nm和OD490 nm處熒光強(qiáng)度。篩選后將底物設(shè)置濃度梯度為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μmol·L-1，用上述方法進(jìn)行檢測，最終所得的熒光數(shù)值用GraphPad Prism （v5.0）計算該酶的米氏常數(shù)（Km）和最大速度值（Vmax）。

1.6 HIV PIs對Emu Ddi1蛋白的抑制效率分析

為了研究沙奎那韋、利托那韋、安普那韋、阿扎那韋、洛匹那韋、福沙那韋、達(dá)蘆那韋7種蛋白酶抑制劑對Ddi1蛋白活性位點的抑制作用，分別用這些藥物與蛋白相互作用，以終濃度為20 μmol·L-1的藥物與10 μg·mL-1重組酶在37 ℃提前作用2 h，然后加入2 μmol·L-1底物，繼續(xù)37 ℃孵育2 h，DMSO和 PBS作為對照，設(shè)置3個重復(fù)孔，最終分別在加入底物0、2 h后時用“1.5”所用的儀器和方法檢測熒光強(qiáng)度。所測數(shù)值統(tǒng)計后用公式抑制率%=（DMSO熒光數(shù)值-待檢HIV PIs各熒光數(shù)值）/DMSO熒光數(shù)值×100%。

1.7 奈非那韋蛋白酶抑制劑的藥效能力分析

為了測定藥物活性和EmuDdi1活性位點對藥物的親和力，進(jìn)而檢測沙奎那韋的IC50，將藥物的濃度用DMSO稀釋為0、1、5、10、20、40、80、160、320、640 μmol·L-1后分別提前與10 μg·mL-1重組蛋白在37 ℃ 反應(yīng)2 h，隨后加入終濃度為2 μmol·L-1 底物，37 ℃反應(yīng)2 h，以PBS為對照，設(shè)置3個重復(fù)孔，最終分別在加入底物0和2 h后時用“1.5”所用的儀器和方法檢測熒光強(qiáng)度，用GraphPad Prism（v5.0）所得熒光數(shù)值作出曲線圖，得出IC50分析的結(jié)果值。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，純化可溶性分泌蛋白

通過M13引物擴(kuò)增鑒定出了pFastBac1-EmuDdi1重組質(zhì)粒的陽性克隆菌株，同時雙酶切驗證和測序比對，符合預(yù)期大小1 281 bp。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后篩選出了正確的P1代，其Western blot結(jié)果顯示，該分泌性靶標(biāo)蛋白在45 ku大小處表達(dá)，符合預(yù)期大小。經(jīng)過P2代病毒的擴(kuò)增和少量Ni柱純化后，Western blot驗證結(jié)果顯示，在45 ku大小處表達(dá)，與P1代的鑒定結(jié)果一致。最終將P2代病毒大量擴(kuò)增，純化出目的蛋白，且Western blot結(jié)果與P2代結(jié)果相符（圖1），成功獲取可溶性目的蛋白。

2.2 pFastBac1-Emu Ddi1重組蛋白活性分析

通過對重組蛋白濃度、反應(yīng)緩沖液pH、緩沖液種類的篩選后，其結(jié)果顯示醋酸鈉緩沖液的效果優(yōu)于三乙醇胺緩沖液，蛋白濃度為10 μg·mL-1，pH7時可得到最高的熒光數(shù)值，說明該合成底物對重組Ddi1蛋白活性位點有很好的切割效果，同時證明了該重組酶在pH7時具有最佳的水解活性，通過酶動力學(xué)曲線分析后得出其Km值為1.422 μmol·L-1（圖2）。以上結(jié)果證明了Emu Ddi1具有良好的蛋白酶活性。

2.3 沙奎那韋對Emu Ddi1蛋白活性的阻斷作用

HIV蛋白酶抑制劑對天冬氨酸蛋白酶的活性結(jié)構(gòu)位點具有抑制和阻斷的作用，通過檢測7種蛋白酶抑制劑對重組EmuDdi1活性的影響，結(jié)果顯示，20 μmol·L-1的沙奎那韋對Emu Ddi1可溶性蛋白有良好的抑制作用，其抑制率分別為67%，其他6種抑制劑對重組蛋白活性沒有很好的抑制效果，同時沙奎那韋IC50為34（圖3），該結(jié)果表明沙奎那韋能有效阻斷Ddi1蛋白活性。

3 討 論

Ddi1是一種泛素依賴性蛋白酶，該蛋白的活性位點位于二聚體兩個亞基之間裂隙的界面上［5］，當(dāng)?shù)孜锏鞍妆粯?biāo)記為大約8個長泛素鏈時才會進(jìn)行切割［10-11］，通過長泛素鏈標(biāo)記合成的HIV蛋白酶底物在體外弱酸環(huán)境pH5時證明了利什曼原蟲Ddi1重組蛋白是一種具有活性的天冬氨酸蛋白酶［12］，同時也驗證了該原蟲Ddi1蛋白是HIV蛋白酶抑制劑的藥物靶標(biāo)，可作為防治病原微生物的化學(xué)治療劑［13］。本研究分析了EmuDdi1重組蛋白酶的活性，而該酶在中性條件下具有最佳水解活性，酶動力學(xué)相關(guān)數(shù)值也證明了該重組蛋白具有良好親和力，評估了Ddi1蛋白的活性，同樣證實Emu Ddi1是天冬氨酸蛋白酶抑制劑治療的潛在藥物靶點。

HIV蛋白酶抑制劑以多種方式和功能對抗疾病，例如通過阻斷上皮細(xì)胞 DNA 合成［14］，阻斷鏈溶酶S的產(chǎn)生［15］，阻斷寄生蟲信號肽酶并阻止巴貝斯蟲在紅細(xì)胞中生長［16］。洛匹那韋、利托那韋和替拉那韋阻斷ste24p蛋白酶水解［17］。洛匹那韋通過引起蟲體脂質(zhì)代謝改變，從而直接抑制天冬氨酸酶并阻止了鞭毛蟲的發(fā)育［18］。沙奎那韋或利托那韋通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，阻斷瘤樣病變細(xì)胞的侵襲［19-20］。相反的，HIV 蛋白酶抑制劑具有副作用或甚至沒有作用，比如蛋白酶抑制劑治療會引起胃腸反應(yīng)和肝損傷的副作用［21］，蛋白酶抑制劑治療白色念珠菌后并沒有減少或抑制對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用［22］。之前的研究發(fā)現(xiàn)奈非那韋通過穿透囊泡抑制包囊生長能力和原頭節(jié)活性，而這一作用和阻斷酶的活性相關(guān)［2］。在本研究結(jié)果中沙奎那韋對Emu Ddi1重組蛋白活性具有67%的抑制效果，IC50檢測是一種標(biāo)志藥物效應(yīng)的一種重要定量指標(biāo)，其結(jié)果也進(jìn)一步評價了沙奎那韋具有良好的藥效性，證明在7種蛋白酶抑制劑中沙奎那韋對 Ddi1蛋白活性具有抑制和阻斷作用。為此，可推測屬于同一類藥物的沙奎那韋可通過穿透包囊，抑制Ddi1蛋白酶活性，從而抑制包囊及原頭節(jié)活力。

為了提高HIV蛋白酶抑制劑的治療效果，有研究將抑制劑與PLGA納米粒子聯(lián)合使用從而降低了弓形蟲腦炎發(fā)生［23］，也有洛匹那韋和奈非那韋聯(lián)合治療改善了腎細(xì)胞癌［24］，利托那韋與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用抑制Phialophora verrucosa增殖［25］。近期研究報道利用分子建模工具預(yù)測分析沙奎那韋與COVID-19蛋白酶活性位點更好的結(jié)合，可作為治療SARS-CoV-2感染的一線藥物［26］。在本研究結(jié)果中沙奎那韋具有較好的藥效性，這可能為探討奈非那韋與沙奎那韋聯(lián)合應(yīng)用對抑制包囊發(fā)展和抑蟲作用提供新依據(jù)。

在體外治療的相關(guān)功能研究中，蛋白酶抑制劑可抑制75%～90%的受精卵轉(zhuǎn)化，有根除瘧疾傳播的潛力［27］，奈非那韋和洛匹那韋治療克魯茲錐蟲病4 h后降低了錐蟲的活力［28］。但是沙奎那韋體內(nèi)外治療效果及奈非那韋聯(lián)合治療效果還需進(jìn)一步證實。HIV PIs 還通過信號傳導(dǎo)途徑抑制病毒復(fù)制和腫瘤細(xì)胞生長，比如通過ROS依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯［9］，通過抑制CD36活化和減緩 CPT-1 脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白來抑制骨骼肌脂肪酸氧化［29］，還可通過下調(diào)Akt通路信號影響NEL對膠原代謝和脯氨酸對膠原生物合成［30］。近期研究表明沙奎那韋通過靶向受體二聚化抑制TLR4激活，從而調(diào)節(jié)宿主TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)險［31］。作者團(tuán)隊之前的研究也表明，奈非那韋可以有效地滲透到包蟲包囊中從而殺死寄生蟲和治療包蟲?。?］，在本研究中發(fā)現(xiàn)沙奎那韋對可溶性重組蛋白的活性具有抑制作用，其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建pFastBac1-EmuDdi1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞系純化出可溶性分泌重組蛋白Ddi1，進(jìn)一步檢測該蛋白的活性和蛋白酶抑制劑對該重組蛋白活性抑制能力，最后篩選得到沙奎那韋具有67%的抑制率和IC50為34的良好藥效性，發(fā)現(xiàn)了沙奎那韋有望成為靶向包蟲病的候選藥物，為沙奎那韋替代其他藥物或聯(lián)合奈非那韋治療包蟲提供新策略。

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（編輯 白永平）