亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        雙酶水解魚鱗蛋白制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化研究

        2022-01-21 14:52:26苑園園王燚欣宋曉鑫
        現(xiàn)代農(nóng)村科技 2022年1期
        關(guān)鍵詞:魚鱗抑制率底物

        苑園園 劉 暢 王燚欣 宋曉鑫

        (衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000)

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(An-giotensin I-converting enzyme,ACE)是導(dǎo)致高血壓的主要因素之一[1]。ACE是人體組織和體液中發(fā)現(xiàn)的一種含鋅的二肽羧基肽酶,能夠?qū)ρ獕浩鸬揭欢ǖ恼{(diào)控作用,血管緊張素Ⅰ可以在人體內(nèi)經(jīng)過ACE的催化作用轉(zhuǎn)化為可以使血管收縮并使血壓升高的血管緊張素Ⅱ[2]。

        我國水資源豐富,在魚類產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生了很多下腳料,其中15%左右都是魚鱗[3],據(jù)不完全統(tǒng)計,我國每年廢棄的魚鱗達(dá)30萬t,魚鱗中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)50%~70%[4,5],是非常好的生物資源。

        目前制備ACE抑制肽多為單一蛋白酶水解,很少模擬胃腸道系統(tǒng)的酶解過程,而經(jīng)其他酶水解得到的ACE抑制肽在人體消化吸收過程中,由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用,其氨基酸序列有可能會發(fā)生變化,進(jìn)而導(dǎo)致ACE抑制能力的變化[6]。因此本試驗選取的雙酶模擬胃腸道消化系統(tǒng)對魚鱗的酶解作用,可能將制備出更高活性的ACE抑制肽[7]。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 材料。新鮮豬肺:衡水市萬德福超市;新鮮鯉魚魚鱗:衡水市桃城區(qū)人民橋水產(chǎn)開發(fā)市場。

        1.1.2 主要試劑。鹽酸(36.0%~38.0%):煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司;四硼酸鈉:天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;乙酸乙酯(AR):天津市大茂化學(xué)試劑廠;硼酸(AR):天津市紅巖化學(xué)試劑廠;胰蛋白酶:河南萬邦實業(yè)有限公司;胃蛋白酶:河南萬邦實業(yè)有限公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸:上海麥克林生化科技有限公司;甘氨酸:天津市大茂化學(xué)試劑廠。

        1.2 儀器與設(shè)備。ST3100型pH計:奧豪斯儀器(常州)有限公司;BGZ-30型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DS-1型高速組織搗碎機:上海標(biāo)本模型廠;Alpha 1-4/2-4 LD Plus德國Christ真空冷凍干燥機:北京五洲東方科技發(fā)展有限公司廣州分公司;A11型研磨機:艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;UV-5500型紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;TGL-16M型離心機:湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 ACE粗酶的制備。新鮮的豬肺冷藏10 h左右,將黏膜、脂肪和氣管切除,將切好的豬肺放入高速組織搗碎機中,之后間歇性勻漿5min,保證比例,每5g的豬肺加入6 ml的硼酸緩沖溶液(pH值8.3,0.1 mol/L),4℃,8 000 r/min離心15 min,收集上清液冷凍干燥備用[8]。

        1.3.2 脫鈣魚鱗粉的制備。收集新鮮的鯉魚魚鱗,用清水洗凈,去除非魚鱗物質(zhì),洗凈后50℃烘干2 h;將烘干后的魚鱗用10%(w/v)NaCl溶液5℃浸泡24 h,換液1次[9],50℃烘干2 h;干燥后的魚鱗用0.4 mol/L的HCl溶液以料液比為1∶15(w/v)浸泡90 min進(jìn)行脫鈣[10],用清水洗凈后再次放入烘箱50℃烘干2 h,放入研磨機打碎得到魚鱗粉冷藏備用。

        1.3.3 魚鱗酶解物的制備。取適量脫鈣魚鱗粉溶于酶的緩沖液中,調(diào)節(jié)整體的pH值在酶的最適范圍內(nèi),加酶進(jìn)行酶解,當(dāng)酶解反應(yīng)完成后應(yīng)立即沸水浴15 min,保證酶徹底失活,待整個反應(yīng)體系冷卻后離心15 min(10℃,4 000 r/min),取上清液[11]。

        1.3.4 ACE抑制率測定。本次試驗采用紫外分光光度法[12]測定ACE抑制率,取酶解物上清液作為ACE抑制肽,將馬尿酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine,HHL)溶于0.1 mol/L(pH值8.3,含Na-Cl)的硼酸鹽緩沖液配成濃度為12.5 mmol/L的底物,先取50μL底物于1.5 ml離心管中,再加入20μLACE抑制肽,兩者混勻后放入水浴鍋37℃保持5 min,接著再取40μLACE溶液于離心管中,放入水浴鍋37℃保持30 min,最后加入200μLHCl(1 mol/L)終止整個反應(yīng),離心管中加入1 ml預(yù)冷過的乙酸乙酯,混合后放入離心機4 000 r/min離心15 min,吸取上層澄清液體750νL到試管中,烘箱內(nèi)120℃烘干15 min,使溶劑全部揮發(fā),冷卻后向試管中加入3 ml的蒸餾水以溶解試管中的馬尿酸,混勻1 min后用紫外可見分光光度計在波長為228 nm下測定溶液的吸光值,計算公式:ACE抑制率(%)=×100%;式中:A為加入ACE抑制劑的吸光度;B為ACE與HHL反應(yīng)的吸光度;C為空白反應(yīng)的吸光度。

        1.4 胃蛋白酶提取條件的單因素試驗及正交試驗優(yōu)化1.4.1單因素試驗。稱取5份脫鈣后的魚鱗粉,料液比分別為1∶10(g/ml)、1∶15(g/ml)、1∶20(g/ml)、1∶25(g/ml)、1∶30(g/ml),利用胃蛋白酶緩沖液調(diào)節(jié)pH值為2.0,溫度控制在37℃,分別調(diào)節(jié)胃蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的條件下,酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h,以ACE抑制率為評價指標(biāo),考察酶解時料液比、胃蛋白酶的添加量、酶解時間對魚鱗ACE抑制率的影響。

        1.4.2 正交試驗優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,設(shè)計L9(34)的正交試驗,見表1。

        表1 胃蛋白酶酶解脫鈣魚鱗粉正交試驗因素水平表

        1.4.3 胰蛋白酶提取條件的單因素試驗優(yōu)化。利用胰蛋白酶緩沖液將胃蛋白酶酶解液pH值調(diào)節(jié)為8.0,溫度控制在40℃,分別調(diào)節(jié)胰蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的條件下,酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h,以ACE抑制率為評價指標(biāo),考察酶解時料液比、胰蛋白酶的添加量、酶解時間對魚鱗ACE抑制率的影響。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 胃蛋白酶酶解的單因素試驗結(jié)果分析

        2.1.1 酶的添加量對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖1,當(dāng)胃蛋白酶添加量增高,ACE抑制率升高,酶的添加量達(dá)到6%時,ACE抑制率最高,酶的添加量繼續(xù)增加,抑制率反而降低。當(dāng)酶過少時,酶與底物結(jié)合的幾率很小,抑制率較低,加酶量到達(dá)一定程度時,酶與反應(yīng)體系中的底物全部結(jié)合,抑制率達(dá)到最大值,但加酶量過多時就會影響底物與之結(jié)合,從而導(dǎo)致抑制率降低。因此,酶的添加量為6%時,魚鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為57.6%。

        圖1 不同胃蛋白酶的添加量下酶解產(chǎn)物的抑制率

        2.1.2 料液比對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖2,料液比增大的同時ACE抑制率也增大,當(dāng)增加到1∶40時達(dá)到最大,隨后抑制率降低。當(dāng)料液比高時,酶解體系比較濃稠,ACE抑制率降低[13]。因此,當(dāng)料液比為1∶40時,魚鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為67.18%。

        圖2 不同料液比下酶解產(chǎn)物的抑制率

        2.1.3 酶解時間對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖3,酶解開始時,ACE抑制肽逐漸釋放其活性,ACE抑制率隨酶解時間的增加而升高,酶解時間為2 h時ACE抑制率最高,時間持續(xù)過長則會適得其反,ACE抑制肽會被酶解喪失活性,ACE抑制率降低[14,15]。因此,當(dāng)水解時間為2 h時,魚鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為79.7%。

        圖3 不同酶解時間下酶解產(chǎn)物的抑制率

        2.2 胃蛋白酶酶解魚鱗蛋白正交實驗優(yōu)化。由表2可知,料液比、酶的添加量、酶解時間這3個因素對ACE抑制率都會產(chǎn)生影響,在9個試驗結(jié)果中,以試驗2、試驗8、試驗9的結(jié)果最好,ACE抑制率基本達(dá)到70%以上,最佳方案為A1B3C2,即料液比1∶50,酶的添加量4%,酶解時間2 h,該組合并未出現(xiàn)在正交表中,所以進(jìn)行驗證試驗,在此條件下,經(jīng)3次平行試驗后測得ACE抑制率為84.89%。通過比較R值可以看出,酶解時間對ACE抑制率的影響最顯著。由表3的F值大小可看出,這3個因素的影響主次順序為:C>B>A。

        表2 胃蛋白酶酶解脫鈣魚鱗粉正交試驗結(jié)果數(shù)據(jù)

        表3 胃蛋白酶酶解脫鈣魚鱗粉正交試驗結(jié)果方差分析

        2.3 胰蛋白酶酶解的單因素試驗結(jié)果分析

        2.3.1 酶的添加量對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖4,酶的添加量較少時,酶與底物結(jié)合機會較少,形成的產(chǎn)物較少;ACE抑制率隨著加酶量的增加而升高,酶的添加量增加到一定程度而底物不變時,酶可以與底物完全結(jié)合,酶的添加量達(dá)到6%時,ACE抑制率最大;再增加胰蛋白酶的添加量時,可能會因為反應(yīng)體系已飽和而降低酶與底物的結(jié)合率導(dǎo)致ACE抑制率逐漸降低。因此,當(dāng)酶的添加量為6%時,魚鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為92.13%。

        圖4 不同酶的添加量下酶解產(chǎn)物的抑制率

        2.3.2 酶解時間對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖5,當(dāng)酶解時間過長時,產(chǎn)生的活性產(chǎn)物可能會被酶解,導(dǎo)致抑制率下降。當(dāng)酶解時間為2 h時魚鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為93.37%。

        圖5 不同酶解時間下酶解產(chǎn)物的抑制率

        3 結(jié)論與討論

        以脫鈣后的鯉魚魚鱗蛋白為原料,通過單因素試驗及正交試驗證明,以胃蛋白酶酶解脫鈣魚鱗粉制備ACE抑制肽,當(dāng)酶的添加量8%、料液比1∶50(g/ml)、酶解時間2 h時,ACE抑制率為84.89%。以胰蛋白酶酶解脫鈣魚鱗粉制備ACE抑制肽,當(dāng)酶的添加量為6%、酶解時間為2 h時,ACE的抑制率為93.37%。結(jié)果表明先用胃蛋白酶酶解,再用胰蛋白酶進(jìn)行酶解,最終得到的ACE抑制肽不會受人體胃腸道的影響。

        猜你喜歡
        魚鱗抑制率底物
        中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
        兩種品牌大腸菌群酶底物法檢測試劑性能的比較
        云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:30:56
        血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
        解析參與植物脅迫應(yīng)答的蛋白激酶—底物網(wǎng)絡(luò)
        科學(xué)(2020年2期)2020-08-24 07:57:00
        遺失的魚鱗
        趣味(語文)(2018年8期)2018-11-15 08:53:02
        日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
        魚鱗瓦(節(jié)選)
        怎樣刮魚鱗不亂飛?
        飲食保健(2017年9期)2017-02-27 09:13:42
        讓士兵更勇敢的魚鱗防彈衣
        泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進(jìn)展
        人妻 色综合网站| 国产午夜福利av在线麻豆| 国成成人av一区二区三区| 极品尤物在线精品一区二区三区 | 久久精品蜜桃亚洲av高清| 日韩人妻中文无码一区二区| 久久精品99久久香蕉国产| 国产亚洲av片在线观看18女人| 国产精品福利久久香蕉中文| 免费高清日本一区二区| 国产成人国产三级国产精品 | 亚洲产在线精品亚洲第一页| 中文字幕影片免费人妻少妇 | 亚洲六月丁香色婷婷综合久久| 日韩精品在线免费视频| 丰满少妇高潮惨叫久久久一 | 午夜人妻中文字幕福利| 日韩一二三四区在线观看| 久久久久99精品成人片欧美| 日韩精品久久久肉伦网站| 色先锋资源久久综合5566| 日本精品久久久久中文字幕1| 狠狠综合久久av一区二区三区| 国产精品会所一区二区三区| 国产午夜精品一区二区| 国产农村妇女高潮大叫| 亚洲女同同性少妇熟女| 色视频不卡一区二区三区| 国产高清在线精品一区app| 国产乱人视频在线播放| 99久久超碰中文字幕伊人| av网站免费在线不卡| 亚洲精选自偷拍一区二| 国产精品嫩草99av在线| 国产黄a三级三级三级av在线看| 亚洲蜜芽在线精品一区| av在线播放免费观看| 久久人妻少妇嫩草av| 日日猛噜噜狠狠扒开双腿小说| 国产尤物二区三区在线观看| 精品日韩在线观看视频|