郭濛濛　邱寶平　符云鵬　郭世英　孟莉　郭連民　趙曉軍　韓富根

摘要：為探討氮用量及氮磷鉀配施比例對(duì)曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分的影響，以曬紅煙品種大葉黃為材料，測(cè)定各處理下不同生育期轉(zhuǎn)化酶（INV）、淀粉酶（AM）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性。結(jié)果表明：在碳代謝的過(guò)程中，低氮處理的INV活性主要在煙葉生長(zhǎng)中期起作用，增施氮肥可促使其作用時(shí)間提前，N：P2O5在1：（0.5～1.0）內(nèi)增施磷肥能增強(qiáng)INV的活性。各處理的AM活性在煙葉生長(zhǎng)中期起作用，增施氮肥能促使煙葉成熟期淀粉酶活性減弱。在氮代謝過(guò)程中，GS活性主要在生長(zhǎng)前期起作用；在煙葉成熟期，中氮水平下Gs活性較強(qiáng)。GDH活性主要在生長(zhǎng)后期起作用，煙葉成熟期的GDH活性在高氮水平下最強(qiáng)，且在同一氮水平下以中鉀水平處理活性較強(qiáng)；曬后煙葉的化學(xué)成分在中氮中磷高鉀處理下較協(xié)調(diào)。

關(guān)鍵詞：曬紅煙；氮用量；氮磷鉀配施比例；碳氮代謝；化學(xué)成分；酶活性

中圖分類號(hào)：S572.06文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0095-03

碳氮代謝是煙株最基本的生理代謝過(guò)程，其代謝強(qiáng)度及在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化對(duì)煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)形成具有重大的影響。氮、磷、鉀是煙草正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)碳氮代謝過(guò)程中各種關(guān)鍵酶活性的變化起決定性的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，在煙草碳氮代謝中，施氮量直接關(guān)系到硝酸還原及整個(gè)氮代謝的強(qiáng)度，適當(dāng)增施氮素對(duì)烤煙光合作用中碳固定代謝具有顯著的促進(jìn)作用；施磷量對(duì)煙葉中后期淀粉酶活性有影響，增施磷肥可以明顯提高烤煙淀粉酶的活性，使碳代謝能力增強(qiáng)；鉀素作為某些酶的催化劑，能直接參與烤煙的碳氮代謝和多種物質(zhì)的合成與運(yùn)輸，增強(qiáng)烤煙的抗逆性，改善煙葉的燃燒性，還與煙葉吃味、香味、香氣量有關(guān)。適宜的氮磷鉀配施比例（簡(jiǎn)稱配比）可協(xié)調(diào)煙葉的內(nèi)在化學(xué)成分，顯著提高煙葉品質(zhì)。吉林省是我國(guó)主要的曬煙產(chǎn)區(qū)之一，目前仍有相當(dāng)部分產(chǎn)地曬煙采用傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，不重視養(yǎng)分的平衡供應(yīng)，缺鉀現(xiàn)象普遍，煙葉鉀含量低、燃燒虛弱。本試驗(yàn)研究氮用量及氮磷鉀配比對(duì)曬紅煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分的影響，為指導(dǎo)曬紅煙合理施肥、提高煙葉品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年在吉林省農(nóng)安縣青山口鄉(xiāng)青山口村進(jìn)行。供試曬紅煙品種為大葉黃，試驗(yàn)地土壤為油沙土，含有機(jī)質(zhì)12.70g/kg、堿解氮142mg/kg、速效磷19.89mg/kg、速效鉀243.54mg/kg，pH值5.52。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)氮磷鉀3因素3水平，氮水平分別為45kg/hm²（N1）、67.5kg/hm²（N2）、90kg/hm²（N3）；磷水平即N：P203分別為1：0.5（P1）、1：1.0（P2）、1：1.5（P3）；鉀水平即N：K20分別為1：1（K1）、1：2（K2）、1：3（K3），共形成9個(gè)處理組合（表1），采用L9。（3⁴）正交試驗(yàn)，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)面積為200m²。試驗(yàn)所用肥料為煙草專用復(fù)合肥（N、P2O5、K2O含量分別為10%、12%、22%）、硝酸銨磷、磷二銨、硫酸鉀等，基追肥比例為8：2。行株距分別為120、50cm，其他栽培管理方式按當(dāng)?shù)刈顑?yōu)措施實(shí)施。

1.3樣品的采集與制備

各處理選擇生長(zhǎng)一致的煙株取中部葉（9～10位葉）進(jìn)行研究，分別在10、20、30、40、50、60葉齡時(shí)取樣，每張葉片取中間部位去除主側(cè)脈，混合后立即用液氮冷凍，在-80℃冰箱中保存，用于煙葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定。同樣部位調(diào)制后的煙葉用于測(cè)定其化學(xué)成分。

1.4指標(biāo)的測(cè)定與方法

1.4.1碳氮代謝關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化酶（INV）活性采用3，5一二硝基水楊酸比色法測(cè)定；淀粉酶活性按照文獻(xiàn)[6]的方法測(cè)定；谷氨酰胺合成酶（Gs）活性測(cè)定參照郝再彬等的方法；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性測(cè)定參照Turano等的方法，在340min處測(cè)定30s內(nèi)吸光度的變化，以1min反應(yīng)混合液于30℃減少1bunol的NADH定義為1個(gè)酶活性單位，GDH活性以1min內(nèi)1mg蛋白催化NADH減少的量（μmol）表示。

1.4.2主要化學(xué)成分按照YC/T159-2002《煙草及煙草制品水溶性糖的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T160-2002《煙草及煙草制品

總植物堿的測(cè)定

連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T161-2002《煙草及煙草制品

總氮的測(cè)定

連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T217-2007《煙草及煙草制品

鉀的測(cè)定

連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T162-2002《煙草及煙草制品氯的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》測(cè)定煙葉中總糖、還原糖、煙堿、總氮、鉀和氯的含量，所用儀器為德國(guó)布朗盧比公司制造的AA3型流動(dòng)分析儀。

1.5數(shù)據(jù)處理

利用Excel2007和SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.結(jié)果與分析

2.1不同處理對(duì)曬紅煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1轉(zhuǎn)化酶（INV）

轉(zhuǎn)化酶與植物的碳代謝密切相關(guān)，可催化細(xì)胞質(zhì)中蔗糖轉(zhuǎn)化成單糖，促進(jìn)葉綠體內(nèi)磷酸丙糖向外運(yùn)轉(zhuǎn)，使葉綠體中的淀粉積累量減少，并通過(guò)與呼吸作用偶聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，使光合碳固定過(guò)程加強(qiáng)。轉(zhuǎn)化酶反映了煙葉對(duì)光合產(chǎn)物的利用程度，是碳代謝強(qiáng)弱的重要標(biāo)志。由表2可知，在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同處理的轉(zhuǎn)化酶活性均呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。N1水平下的活性高峰出現(xiàn)在30葉齡時(shí)，N2、N3水平下的活性高峰出現(xiàn)在20葉齡時(shí)，且N1水平下的活性高峰值高于N2、N3水平，在20葉齡時(shí)各處理間差異不顯著，說(shuō)明增施氮肥不能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化酶的活性而會(huì)促使其活性高峰期提前、下降時(shí)間前移。在代謝旺盛時(shí)期，同一氮水平下，P2水平下的煙葉轉(zhuǎn)化酶活性最強(qiáng)；在60葉齡時(shí)，各處理轉(zhuǎn)化酶活性差異不顯著。說(shuō)明在煙葉生長(zhǎng)前期，P2處理能增強(qiáng)煙葉轉(zhuǎn)化酶的活性，有利于糖類物質(zhì)的外運(yùn)，加強(qiáng)體內(nèi)代謝，促進(jìn)葉片快速生長(zhǎng)；但在煙葉成熟時(shí)期，不同處理對(duì)葉片轉(zhuǎn)化酶活性的影響不顯著。

2.1.2淀粉酶（AM）

淀粉酶是碳水化合物代謝過(guò)程中的重要酶類，可將葉綠體光合作用中積累的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，因而直接關(guān)系到煙葉中淀粉的積累量，進(jìn)一步影響整個(gè)光合碳固定的強(qiáng)度，最終影響到煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性及其香吃味。由表3可以看出，不同處理煙葉淀粉酶的活性在生長(zhǎng)前期基本呈增強(qiáng)趨勢(shì)，在30葉齡時(shí)達(dá)到高峰，之后持續(xù)減弱。在30葉齡時(shí)，各處理間差異不顯著，且以T6（N2tBKI）處理最高；在煙葉成熟后期，葉片淀粉酶活性從強(qiáng)到弱依次為Nl>N3>N2，且在同一氮水平下K2處理葉片淀粉酶活性較高。說(shuō)明低氮處理能增強(qiáng)葉片淀粉酶的活性，同一氮水平下中鉀處理也能增強(qiáng)葉片淀粉酶的活性，促進(jìn)淀粉向糖的轉(zhuǎn)化，使煙葉碳代謝增強(qiáng)。在葉片成熟期，各處理中以T2（NIP2K2）水平下葉片淀粉酶活性最高。

2.1.3谷氨酰胺合成酶（GS）

GS是氮素同化的關(guān)鍵酶，作物吸收氮素岳在Gs的作用下合成谷氨酰胺，GS活性可以反映氮素的同化能力，與煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。從表4可以看出，在煙葉發(fā)育過(guò)程中，不同處理的GS活性的變化規(guī)律表現(xiàn)不一致。GS活性高峰出現(xiàn)在20葉齡時(shí)，以T4（N2PIK2）處理活性較高，T1處理次之，其他處理都維持在較低的水平；在煙葉成熟期，Gs活性較低，這可能與煙株氮素重新分配有關(guān)，各處理葉片Gs的活性在中氮、低氮水平下從強(qiáng)到弱依次為N2>N1>N3。說(shuō)明適宜的氮水平能促進(jìn)煙抹的氮代謝，有利于氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化。

2.1.4谷氨酸脫氫酶（GDH）谷氨酸脫氫酶是植物氮素代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，能催化谷氨酸的合成和分解代謝。GDH是一種適應(yīng)性酶，其作用主要由細(xì)胞內(nèi)對(duì)谷氨酸和碳骨架的需求所決定。當(dāng)碳代謝受阻時(shí)，GDH的活性會(huì)增強(qiáng)。從表5可以看出，在中部葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同施肥處理GDH活性總體呈現(xiàn)出先增強(qiáng)岳將弱的趨勢(shì)，各處理的GDH活性均在50葉齡時(shí)達(dá)到最高，且各處理之間差異不顯著，說(shuō)明不同氮用量和氮磷鉀配比對(duì)GDH活性影響不大。在60葉齡后出現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。說(shuō)明隨著葉片的生長(zhǎng)，GDH活性逐漸增強(qiáng)，發(fā)育后期隨著植株的衰老光合能力下降，氮素在體內(nèi)積累。

2.2不同處理對(duì)曬制后中部葉化學(xué)成分的影響

從表6可知，隨氮用量的增加，總氮和煙堿含量增加。低氮水平下，隨磷、鉀用量的增加，總糖含量提高，總氮和煙堿含量顯著下降。中氮水平下，中磷、高鉀水平（即T5）處理煙葉的煙堿含量顯著最低，且總糖含量也最低，這可能與調(diào)制期間糖消耗多有關(guān)。高氮水平下，隨磷用量的增加，總氮、煙堿含量提高，總糖含量也有不同程度的增加，說(shuō)明氮用量和磷用量對(duì)曬紅煙碳水化合物和含氮化合物的含量影響較大。在中氮水平下，隨著鉀用量的增加，K2O含量呈增加趨勢(shì)。各處理中以中氮、中磷、高鉀（即T5）處理的煙葉鉀含量顯著高于其他處理，說(shuō)明氮、磷水平過(guò)高會(huì)影響煙葉中鉀的積累。隨著氮用量的增加，煙葉氯含量增加，且在同一氮水平下均以低磷處理最低，說(shuō)明低氮低磷處理可降低煙葉中的氯含量。

3.結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著葉片的生長(zhǎng)和成熟，INV活性均表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，這與趙憲鳳等的研究結(jié)論一致。增施氮肥并不能增強(qiáng)代謝旺盛時(shí)期轉(zhuǎn)化酶的活性，但可以促使其代謝高峰期前移。N：P2O5在1：0.5～1.0范圍內(nèi)增施磷肥能增強(qiáng)NV的活性，使碳代謝能力增強(qiáng)，有利于糖類物質(zhì)的外運(yùn)，加強(qiáng)體內(nèi)代謝，促進(jìn)葉片快速生長(zhǎng)。在煙葉成熟時(shí)期，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對(duì)煙葉成熟期INV活性的影響不顯著。在整個(gè)生育期，不同處理的AM活性呈“減弱增強(qiáng)減弱”的趨勢(shì)，在30葉齡時(shí)代謝比較旺盛。在代謝旺盛的時(shí)期，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對(duì)AM活性影響不顯著。在葉片成熟時(shí)，低氮或中鉀處理均能增強(qiáng)葉片AM活性，促進(jìn)淀粉向糖轉(zhuǎn)化，煙葉碳代謝增強(qiáng)。在本試驗(yàn)處理下，葉片AM活性在煙株發(fā)育前期較強(qiáng)，之后減弱，在煙葉成熟期活性較弱。這可能是因?yàn)榍捌谕寥乐械睾扛?，刺激了煙株的氮代謝，隨著土壤中可利用氮素含量的降低，煙株中GS活性也隨之減弱，至60葉齡時(shí)GS活性又增強(qiáng)，標(biāo)志著煙抹氮素重新分配。在一定范圍內(nèi)隨著氮用量的增加，GS活性增強(qiáng)，但氮用量過(guò)高會(huì)抑制GS活性，不利于氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化。在整個(gè)生育期，GDH活性與GS活性存在相互映襯的關(guān)系。GS活性在50葉齡時(shí)較弱，而GDH在50葉齡時(shí)最高，這是因?yàn)镚DH作為Gs在不利情況下活性減弱的一種補(bǔ)償，這也是Ireland等研究的關(guān)于當(dāng)碳代謝受阻時(shí)，GDH活性會(huì)增強(qiáng)的一個(gè)例證。本研究結(jié)果表明，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對(duì)GDH活性較強(qiáng)時(shí)期的GDH活性影響不明顯。在煙葉成熟期，在煙葉成熟期，在高氮水平下GDH活性較高，且在同一氮水平下以K：處理其活性最強(qiáng)。煙株碳氮代謝的相互作用是影響調(diào)制后煙葉質(zhì)量和化學(xué)成分的根本因素，從以上分析可以看出，降低氮用量、增加施磷比例可以提高曬后煙葉糖含量；降低氮用量可降低煙葉煙堿、總氮的含量；在中氮水平下，增加鉀用量可提高煙葉中K20含量；低氮低磷處理可降低煙葉中氯的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在中氮中磷高鉀（即T5）處理下煙葉化學(xué)成分較協(xié)調(diào)。