包 敏,宋銘忻

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物源性人獸共患病黑龍江省重點實驗室,黑龍江哈爾濱150030;2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧錦州 121001)

雞后口吸蟲(PostharmostomumgallinumWitenberg,1923)屬于短咽科(Brachylaimidae Stiles et Hassal,1892)后口屬(Postharmostomum),寄生于雞、火雞、鴿等終末宿主的盲腸,引起后口吸蟲病。關于此病僅在廣東、福建、上海、江西、四川[1-3]地區(qū)有少量報道,而且主要集中在蟲體結構的觀察。本研究通過對遼寧錦州地區(qū)家雞盲腸中分離的后口吸蟲進行形態(tài)學觀察和DNA提取,分析ITS rDNA序列,為后口吸蟲的流行病學調查和分子診斷打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體及蟲卵 2023年3月,遼寧省錦州市周邊某養(yǎng)殖戶送檢6只發(fā)病的開產(chǎn)蛋雞,采用寄生蟲學剖檢法后分別于不同雞只的雙側盲腸中收集到5～23條數(shù)量不等的活蟲,經(jīng)生理鹽水沖洗后,進行成蟲的形態(tài)學鑒定;另取1條活蟲在玻璃器皿中剪碎,用手術刀片輕輕擠壓蟲體,使蟲卵從蟲體中逸出,用生理鹽水反復洗滌后,收集蟲卵沉淀物備用;其余蟲體于70%乙醇中固定。

1.1.2 主要試劑 Tissue DNA Kit,美國奧美嘉生物技術公司產(chǎn)品;RT-qPCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;ExTaqDNA聚合酶,dNTPs,DL 2 000 DNA Marker,pMD18-T載體,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 OLYPUS光學顯微鏡(BX53F),日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;PCR擴增儀(System 9700),基因有限公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-12),北京六一科技有限公司產(chǎn)品;天能凝膠成像系統(tǒng)(1600),上海天能科技有限公司產(chǎn)品;蔡司掃描電子顯微鏡(EVO MA 10),廣東省東莞市三本精密有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 成蟲及蟲卵的光鏡觀察 肉眼觀察蟲體的基本形態(tài),將新鮮的蟲卵及成蟲分別制成玻片標本[4],用光學顯微鏡和體視顯微鏡觀察,記錄蟲種的大小、形態(tài)、口吸盤、咽、腹吸盤、卵巢、睪丸等器官的特征,根據(jù)相關文獻記錄的形態(tài)學要點鑒定蟲種。

1.2.2 蟲卵的電鏡觀察 將生理鹽水清洗過后的蟲卵樣本用2.5%戊二醛浸泡過夜,用滅菌純化水漂洗,3 000 r/min離心5 min,重復3次;取沉淀依次用80%、90%乙醇和無水乙醇脫水各30 min,然后將無水乙醇混懸的蟲卵移至直徑小于2 cm的圓形載玻片上,待發(fā)干后,噴金,掃描電鏡下拍照。

1.2.3 rDNA ITS基因序列的PCR擴增及序列分析 取3條蟲體和蟲卵,分別置于無菌EP管中,利用組織DNA提取試劑盒提取蟲體總DNA,提取的DNA樣品在-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的DNA為模板,利用吸蟲ITS的通用引物NC5:5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′,NC2:5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′,PCR擴增ITS基因序列。反應體系為 25 μL;反應條件為:92℃ 2 min,92 ℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min 20 s,共35個循環(huán),72℃延伸5 min。擴增結束后,取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢查結果。將電泳結果呈陽性的PCR產(chǎn)物送至北京生工生物技術公司進行雙向測序。利用生物學軟件DNAStar,將獲得吸蟲的ITS-2基因序列與NCBI中同源性最高的吸蟲ITS序列進行比對分析,以分體屬埃及分體吸蟲Schistosomahaematobium(KJ137231)和曼氏血吸蟲Schistosomamansoni(X153)作為外群,利用Clustal X 1.83 和 MEGA 6.1軟件繪制其遺傳進化樹,探究本吸蟲的系統(tǒng)發(fā)生位置[5-6]。

2 結果

2.1 成蟲的形態(tài)學鑒定

蟲體未經(jīng)染色,使用體視顯微鏡觀察玻片標本,顯示其形態(tài)與文獻[7-9]中后口吸蟲的描述一致。蟲體寄生在宿主的雙側盲腸中,透過盲腸壁的漿膜面可以看到蟲體吸附在黏膜面上,盲腸中的全部或部分內容物中混有血液,蟲體因吸血而呈黑褐色。蟲體無活動性,呈長舌形或鞋底狀,體表光滑,體長3.9～9.7 mm、寬1.2～2.3 mm。蟲體頭端鈍圓,從口吸盤開始到末端,兩側寬窄度接近一致,一直到蟲體末端兩側向內收緊,逐漸變?yōu)閳A錐形。

口吸盤、咽、腹吸盤發(fā)達,口吸盤位于蟲體的前端,明顯大于腹吸盤,大小為(0.068～0.093) mm×(0.064～0.081) mm,口孔的直徑與咽部的外徑大小接近相等,口吸盤的肌肉發(fā)達堅實,口吸盤基部肌肉暗黑色、寬闊厚實、外觀呈方向盤樣?？谖P下直接與咽部相連接,咽部大小為(0.032～0.046) mm×(0.036～0.047) mm,咽部外觀白色,呈水罐形或榛子形,上部寬闊底部逐漸變窄,頂端收緊、開口處連接于與口孔的下端。腹吸盤距離口吸盤和咽部較遠,腹吸盤上緣到咽部底端距離約為0.084 mm～0.091 mm。腹吸盤大小為(0.059～0.087) mm×(0.058～0.073) mm,肌肉的發(fā)達程度明顯不及口吸盤,肌肉外觀顏色淡薄。2條盲腸粗大,形成10～12個波浪形的彎曲伸達到蟲體的后端,新鮮蟲體的腸腔中充滿血液,前段呈淡紅色,末端為暗紅色盲囊狀。2個睪丸前后傾斜排列于蟲體后2/5處,前睪丸呈橢圓形,大小為(0.055～0.076) mm×(0.044～0.063 )mm,后睪丸呈四方形或長橢圓形,大小為(0.067～0.085) mm×(0.041～0.055 )mm。卵巢呈圓形,位于兩個睪丸的對側,卵巢、兩個睪丸三者之間排列形成一個三角形位置關系。卵黃腺十分發(fā)達,排列密實緊湊,分布在蟲體兩側,左右兩側支的內面與卵巢和睪丸之間緊密相貼,前起于腹吸盤后緣,后止于睪丸與卵巢之間。子宮發(fā)達,前方由咽喉中部位置起向后延伸,一直到蟲體的后部,腹吸盤為子宮上行支和下行支的分界點,子宮的上行支呈舒展樣樹枝狀,位于咽與腹吸盤之間,下行支呈螺旋樣分支狀,位于腹吸盤與前面睪丸之間(圖1)。觀察結果表明本研究分離的吸蟲在形態(tài)學上鑒定為雞后口吸蟲。

A.口吸盤;B.咽;C.子宮;D.腹吸盤;E.卵黃腺;F.盲腸;G.卵巢;H.睪丸

2.2 蟲卵的形態(tài)學鑒定

蟲卵呈淡黃色,卵殼光滑,體積甚小,一端窄、一端鈍圓,芝麻粒狀。窄端有一個疣狀突起,有一個表面平整的卵蓋,卵蓋邊緣無突起樣結構。多數(shù)蟲卵的卵殼左右兩側不對稱,一側卵殼平整,另一側卵殼向外突出呈隆起狀,隆起處偏于蟲卵的鈍端。卵殼較厚,表面質地緊密,呈顆粒狀,卵內有毛蚴,卵殼與內部結構之間無空隙。蟲卵長為30.34 μm±1.71 μm(28.72～34.16 μm),寬為18.54 μm±2.01 μm(15.03～24.64 μm)(圖2)。

A.芝麻樣外形(400×);B.卵殼表面呈顆粒樣(10 000×);C.左右不對稱(1 000×);D.寬端(4 000×)

2.3 rDNA ITS基因序列的擴增及分析

利用通用引物擴增3條成蟲和蟲卵的rDNA ITS基因序列,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,PCR擴增雞后口吸蟲的部分ITS基因序列,4個吸蟲陽性PCR產(chǎn)物均成功雙向測序,擴增的條帶均出現(xiàn)在相同位置,與預期目的片段一致,且無特異性條帶(圖3)。基因片段經(jīng)測序后經(jīng)人工矯正,得到完整的ITS序列,4條蟲體的ITS序列基本一致,擴增產(chǎn)物大約為1 646 bp,由于NCBI缺少該吸蟲ITS全序列,因此,與Postharmostomumcommutatum(MH915391)的部分ITS序列進行比較,同源性達到99.76%。

M.DNA標準DL 2 000;1～3.成蟲DNA的PCR擴增產(chǎn)物;4.蟲卵DNA的PCR擴增產(chǎn)物;5.陰性對照

2.4 雞后口吸蟲系統(tǒng)進化分析

利用部分ITS基因作為基因標記構建系統(tǒng)進化樹,分體屬埃及分體吸蟲(Schistosomahaematobium)(KJ137231)和曼氏分體吸蟲(Schistosomamansoni)(X153)作為外群,選擇異雙盤屬(Leucochloridium)的4個蟲體ITS序列與本研究的雞后口吸蟲的部分ITS序列一起構建進化樹,結果顯示,包括本研究在內的后口屬吸蟲(Postharmostomum)形成獨立的一個分支,支持率達到100%,符合該屬的獨特地位,異雙盤屬(Leucochloridium)的4個吸蟲聚集在另一個大分支內,雙盤屬與后口屬吸蟲均為短咽科(Brachylaima)(圖4)。

圖4 后口吸蟲的系統(tǒng)進化樹

3 討論

吸蟲病需要有軟體動物參與才能完成生活史,后口吸蟲屬于短咽科,以陸地螺等作為中間宿主[10],在放養(yǎng)過程中家雞喜好啄食地面的軟體動物、昆蟲等[11],此過程正好將感染了吸蟲幼蟲的陸地螺吞食體內,螺體內的幼蟲進入雞體繼續(xù)其發(fā)育過程,造成感染,因此,散養(yǎng)雞感染吸蟲病比較普遍[12]。后口吸蟲在盲腸中寄生,依靠口吸盤、腹吸盤附著在腸黏膜上蠕動和移行,一方面,吸盤機械性刺激、損傷腸黏膜,引起出血性腸炎,肉眼觀盲腸黏膜腫脹、盲腸尖和盲腸體呈彌漫性出血;另一方面,蟲體奪取宿主的血液和腸上皮細胞,腸腔中堆積的大量血液、蟲體的代謝產(chǎn)物與盲腸內容物混合在一起,影響了盲腸正常的消化吸收功能,雞出現(xiàn)貧血、消瘦等消耗性癥狀和病變,在繼發(fā)和混合感染或有其他應激因素存在時出現(xiàn)死亡。因此,在重視雞飼養(yǎng)管理的同時,應該關注為雞定期驅蟲[13]。

短咽科吸蟲寄生在禽類和哺乳類的腸道以及禽類的腔上囊,該科吸蟲的相關描述尚不完整,此外,短咽科的分子方面研究極少。本次發(fā)現(xiàn)的后口吸蟲蟲卵在光鏡下觀察的結果為芝麻形,與陳克強報道的橢圓形有所不同[14]。本次研究最終確定所分離的吸蟲為雞后口吸蟲,為遼寧省首次報道,該結果為雞消化道蠕蟲流行病學調查及短咽科吸蟲分子鑒別診斷提供了科學依據(jù)。