邵天人,吳善博,張雅芳,謝靜靜,趙利杰,孫露露,邊嘯坤,王榮軍

(河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河南鄭州 450046)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是僅次于輪狀病毒感染引起2歲以下兒童腹瀉和死亡的第二大病因,對免疫抑制病人也具有很大的威脅,是艾滋病檢測指標之一[1]。動物普遍感染隱孢子蟲,可導致幼齡動物嚴重腹瀉和死亡,嚴重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展[2]。隱孢子蟲屬內具有廣泛遺傳多態(tài)性,已鑒定出47個有效種及70多個隱孢子蟲基因型,其中微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)是最為重要的人獸共患蟲種[3-4]。目前,治療隱孢子蟲病尚未有特效藥物或疫苗,只有硝唑尼特被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準使用,但僅能緩解中度感染的兒童和免疫正常人群的癥狀,對人免疫缺陷病毒(HIV)感染者無效[5]。

哺乳動物細胞中存在大量非蛋白質編碼RNA轉錄本,即所謂的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)。這些非編碼RNA種類繁多,根據(jù)表達和功能可分為2類,即管家非編碼RNA和調控性非編碼RNA。管家非編碼RNA是細胞生存所必需的,含量較為恒定,呈組成型表達,也稱為組成型非編碼RNA[6]。調控性非編碼RNA主要可分為3類,即內源性的微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA),其表達具有明顯的時空特異性,通常呈短暫表達,對轉錄、翻譯等過程起調節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn),宿主上皮細胞ncRNA在防御隱孢子蟲感染的先天免疫反應中發(fā)揮重要作用,包括抗菌肽的產(chǎn)生、細胞因子/趨化因子的表達、上皮細胞源外泌體的釋放、免疫同型趨化酶的反饋調節(jié)、炎癥反應等[8]。本文綜述了宿主上皮細胞miRNA、lncRNA和circRNA在防御隱孢子蟲感染過程中的作用機制。

1 miRNAs

miRNA是一類長度約20～23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,可與靶標mRNA結合并使mRNA降解或阻礙其翻譯,從而抑制靶基因的表達[9]。芯片分析及RNA-sequencing分析顯示,C.parvum感染誘導上皮細胞miRNA表達譜發(fā)生改變,且miRNA在對抗C.parvum感染的先天免疫防御過程中發(fā)揮重要功能[10]。

1.1 Let-7i

研究表明,let-7家族成員let-7i在抗隱孢子蟲感染過程中通過各種調節(jié)機制進行精密調控。例如,C.parvum感染以MyD88/NF-κB依賴的方式降低宿主細胞let-7i表達,這一過程參與了C.parvum感染誘導的上皮細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)表達上調以促進TRL4介導的抗C.parvum的防御反應[11]。O'Hara S P等[12]利用培養(yǎng)的膽管上皮細胞(H69),發(fā)現(xiàn)C.parvum感染在降低let-7i表達和啟動子活性的同時促進調控序列中NF-κB 亞單位p50-C/ ebp β沉默子復合體的形成,從而阻遏復合體結合到let-7i啟動子并促進組蛋白h3去乙?；?。此外,let-7i下調可緩解miRNA介導的NAD 依賴性去乙?；竤irtuin-1(SIRT1)翻譯抑制以調節(jié)NF-κB的活化[13]。這些均提示let-7i表達的轉錄調控在上皮細胞抵御隱孢子蟲感染的先天性免疫反應中的新作用。

1.2 miRNA-98

細胞因子誘導的Src同源蛋白2(CIS)是新興的胞內蛋白家族,已成為各類細胞中細胞因子反應的關鍵生理調節(jié)因子[14]。Hu G等[15]在C.parvum感染的H69細胞中檢測到miR-98表達下調并賦予H69細胞CIS表達,并通過CIS過表達和siRNA干擾試驗證明CIS可增強人NF-κB抑制蛋白α(IκBα)降解,促進C.parvum感染后H69細胞中NF-κB的活化。由此表明,miRNA 對CIS表達的調節(jié)可能在上皮細胞對微生物挑戰(zhàn)反應的TLR/NF-κB信號的反饋調節(jié)中發(fā)揮重要作用。

1.3 miRNA-513

炎癥刺激下H69細胞可表達幾種B7共刺激分子,其中B7-H1是一種新發(fā)現(xiàn)的B7成員,在細胞介導的免疫應答中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用[16]。Gong A Y等研究表明,miR-513參與促炎細胞因子IFN-γ誘導的膽管細胞中B7-H1表達;在C.parvum感染的H69細胞中發(fā)現(xiàn)miR-513表達下調并緩解miRNA介導的B7-H1翻譯抑制,且B7-H1的表達參與了膽管細胞與T細胞之間的相互作用[17]。因此,miR-513在膽管細胞中對C.parvum誘導B7-H1表達的調節(jié)作用可能與C.parvum感染相關的膽汁免疫應答反應有關。

1.4 miRNA-27b

一氧化氮(NO)曾被證明在上皮細胞對C.parvum的防御過程中發(fā)揮作用[18]。研究表明,C.parvum感染后以NF-κB依賴的方式誘導上皮細胞產(chǎn)生NO,并參與miRNA介導的誘導型NO合酶(iNOS)mRNA的穩(wěn)定[19]。具體而言,C.parvum感染可引起宿主上皮細胞iNOS mRNA穩(wěn)定性增強,從而促進感染細胞中NO的產(chǎn)生。有趣的是,iNOS mRNA穩(wěn)定的潛在機制與KH型剪接調節(jié)蛋白(KSRP)的抑制有關,且miR-27b可靶向KSRP 3'UTR導致翻譯抑制使C.parvum感染負荷降低。由此表明,miR-27b通過靶向KSRP調節(jié)C.parvum感染后iNOS mRNA穩(wěn)定性可能與一般上皮細胞抗微生物防御的調節(jié)有關。

1.5 miR-424-503

miR-424和miR-503是由X染色體上miR-424-503基因位點編碼的成熟形式[20]。組蛋白去乙?；?HDAC)具有免疫調節(jié)活性,在宿主抗微生物防御過程中發(fā)揮重要作用[21]。趨化因子CX3CL1(也稱為fractalkine)是CX3C家族的獨特成員,它僅與其受體 CX3CR1結合,并且是其受體的獨特配體。Zhou R等[22]的研究揭示了HDACs和NF-κB信號在C.parvum感染后上皮細胞趨化因子CX3CL1在表達調控中的新作用,即HDACs和NF-κB信號通過抑制miR-424-503基因調節(jié)上皮細胞表達CX3CL1的表達,以促進黏膜上皮細胞對C.parvum感染的防御。

1.6 miR-942-5p

研究表明,miR-942-5p的差異表達參與調節(jié)C.parvum感染后宿主上皮細胞免疫應答,且C.parvum依賴TLR2/TLR4-NF-κB信號通路上調人結直腸腺癌(HCT-8)細胞中miR-942-5p的表達[10,23]。為探索miR-942-5p在C.parvum誘導的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)介導的HCT-8細胞凋亡調控中的作用,Xie F等[24]在C.parvum感染早期檢測到miR-942-5p表達上調且緩解了miRNA介導的IFI27翻譯抑制,而IFI27下調通過TRAIL依賴途徑調節(jié)細胞凋亡從而影響C.parvum感染負荷。該研究結果揭示了一種新的miRNA在宿主體內抗C.parvum感染的上皮細胞防御反應機制。

1.7 miR-181d

微陣列分析結果顯示,miR-181d在C.parvum感染的HCT-8細胞中差異表達[10]。Feng R等[25]在C.parvum感染早期HCT-8細胞中檢測到miR-181d表達顯著下調,而TLR2、TLR4、NF-κB和參與TLR/NF-κB信號通路的myD88顯著上調。為了更深入研究宿主miRNA在C.parvum感染固有免疫反應中的作用,qPCR和Western blot證實C.parvum通過p50亞基依賴的TLR2/ TLR4-NF-κB信號通路下調HCT-8細胞中miR-181d的表達。

2 LncRNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是由RNA聚合酶II轉錄而來的副產(chǎn)物,主要以RNA的形式參與X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾以及轉錄激活和干擾等多種重要的調控過程[26]。研究發(fā)現(xiàn),一些lncRNA可在先天性免疫細胞中被誘導表達,且很可能在先天防御的調控中發(fā)揮關鍵作用[27]。目前有關lncRNA在寄生蟲領域的作用機制研究較少,因此進一步深入了解其相關作用機制十分重要。

2.1 LncRNA-NR_045064

鑒于lncRNA在腸上皮細胞抗微生物防御中的作用,Li等[28]對C.parvum感染后腸上皮細胞中l(wèi)ncRNA表達譜進行測序,其中由NF-κB信號控制的lncRNA NR_045064顯著上調。另外在功能上,誘導NR_045064表達可增強感染細胞中部分防御基因的轉錄并抑制C.parvum感染負荷,且表觀遺傳組蛋白修飾和p300/MLL相關染色質重塑均參與該過程。因此,lncRNA可能代表了腸上皮細胞抗C.parvum感染防御機制的一種新型調節(jié)臂。

2.2 LncRNA-XR_001779380

全基因組轉錄分析結果顯示,C.parvum感染的IEC4.1細胞中表現(xiàn)出lncRNA表達譜的顯著改變,其中IncRNA XR_001779380是上調差異最為顯著的基因之一[28]。IFN-γ是上皮細胞抗C.parvum防御的關鍵效應分子[29]。PRDM1作為一種轉錄抑制因子,可與活化信號傳導及轉錄激活蛋白1(signal transducer and activator of transcription,STAT1)的蛋白抑制劑相互作用,調節(jié)STAT1介導的基因轉錄[30]。研究顯示,XR_001779380與PRDM1的相互作用減弱了IFN-γ誘導的STAT1/SWI/SNF相關染色質重塑,從而抑制了IFN-γ介導的新生兒腸上皮細胞防御[31]。這些結果表明,XR_001779380是IFN-γ介導的基因轉錄和年齡相關的腸上皮細胞抗C.parvum防御的重要調節(jié)因子。

2.3 LncRNA-NR_033736

有研究揭示了隱孢子蟲感染腸上皮可引起強烈的Ⅰ型IFN反應[32]。同時,Li等[33]在C.parvum感染的腸上皮細胞中鑒定出lncRNA NR_033736可組裝成ISGF3復合物并抑制Ⅰ型IFN介導的基因轉錄。有趣的是,NR_033736本身的上調是由Ⅰ型IFN信號觸發(fā)的,且NR_033736可調節(jié)上皮細胞抗隱孢子蟲防御。由此表明,上調NR_033736通過抑制Ⅰ型IFN控制的基因轉錄對Ⅰ型IFN信號通路進行負反饋調節(jié),從而有助于上皮細胞對微生物感染的固有防御做出微調。

3 CircRNA

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種不含5′帽或3′polyA尾的共價閉環(huán)分子,不同于傳統(tǒng)線性RNA,它主要在細胞中充當海綿體吸附miRNA,從而解除miRNA對其靶基因的抑制作用[34]。宿主circRNA的差異表達是由各種病原體感染所引起,包括細菌、病毒和寄生蟲等[35]。研究表明,隱孢子蟲感染可誘導HCT-8細胞中circRNA表達譜顯著變化,這一發(fā)現(xiàn)具有深遠意義[36]。然而,卻很少有研究報道有關circRNA在隱孢子蟲感染中的調控機制。

微陣列分析結果顯示,C.parvum感染后HCT-8細胞中共178個circRNA差異表達,其中hsa_circ_0001946_CBC1(ciRS-7,也稱為CDR1as)顯著上調近8倍[37]。RelA(也稱為p65)是NF-κB信號通路的一個亞基,可防止上皮細胞發(fā)生凋亡從而有益于寄生蟲繁殖[38]。另一研究顯示,miR-1270是ciRS-7高度匹配的miRNA并直接靶標relA,且ciRS-7通過調節(jié)miR-1270/relA軸影響NF-κB通路以促進C.parvum繁殖[39]。這些研究均為實施針對隱孢子蟲感染的調控策略提供了新視角。

4 展望

ncRNA是生命科學領域發(fā)展最迅速的前沿領域之一,其中miRNA、lncRNA、circRNA被稱為“RNA三寶”,受到研究者們廣泛關注。近些年來,宿主上皮細胞ncRNA在防御隱孢子蟲感染的先天免疫反應中的作用機制不斷被報道,但多數(shù)研究集中于miRNA,有關lncRNA和circRNA的研究較少。隨著研究的不斷深入,終將闡明上皮細胞ncRNA調控隱孢子蟲感染的分子機制,揭開lncRNA、miRNA、circRNA、mRNA之間相互作用以及ceRNA調控網(wǎng)絡的神秘面紗,為設計開發(fā)隱孢子蟲診斷試劑、抗隱孢子蟲病藥物和疫苗等提供新的理論基礎。