邱鴻宇，蘭卓，果馨儒，吳婷婷，姜巖，金程佳，張曉軒，王春仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

棘口吸蟲為棘口科（Echinostomatidae）吸蟲的統(tǒng)稱，種類較多，包括棘口亞科（Echinostomatinae）、棘隙亞科（Echinochasminae） 等11 個亞科，棘口屬（Echinostoma）、棘隙屬（Echinochasmus）、似頸屬（Isthmiophora）等51 個屬的蟲體600 多種，這類吸蟲主要寄生于哺乳類和鳥禽類，大約有20 多種可以感染人[1-3]。日本棘隙吸蟲（Echinochasmus japonicus）和圓圃似頸吸蟲（Isthmiophora hortensis，圓圃棘口吸蟲（Echinostoma hortensis）的同物異名就是其中重要的種類。日本棘隙吸蟲主要終末宿主為犬和貓，還感染雞、鴨等家禽及白鷺等野生鳥類，鼠類和食蟲動物也可成為其自然終末宿主，淡水螺和淡水魚為其第一中間宿主和補充宿主，主要流行于中國、日本、韓國、科威特、老撾、俄羅斯、泰國和越南等地[3-7]。圓圃似頸吸蟲的終末宿主為犬和貓，豬和鼠類也有感染的報道，第一中間宿主也是淡水螺，泥鰍和蛙為其第二中間宿主，主要流行于中國、日本、韓國[3-4，8-10]。兩種蟲體均寄生于宿主的腸道中。動物是因采食生的淡水魚蛙而獲感染，感染后的主要癥狀集中在消化系統(tǒng)，如腹瀉、腹痛、食欲不振等，重度感染可見腸黏膜出血、腸炎，導(dǎo)致脫水，嚴重者可引起死亡，對犬貓飼養(yǎng)影響很大[1-3]。同時，兩種吸蟲均可以感染人，具有重要的公共衛(wèi)生意義[3-4]。

寄生蟲的準確鑒定是寄生蟲病防控和科學(xué)研究的基礎(chǔ)，過去對寄生蟲的分類鑒定主要依賴于形態(tài)學(xué)方法，但這種方法對于形態(tài)相似的蟲體存在一定的局限性。棘口吸蟲不僅種類繁多，而且很多種類形態(tài)相似，同一屬內(nèi)，甚至同一亞科內(nèi)的蟲體也很相似。頭棘的數(shù)量和排列是棘口科吸蟲鑒定的一種重要標(biāo)志，然而同一屬中的不同種的頭棘數(shù)量也不盡相同，不同屬間頭棘的數(shù)量也有相同的，這就大大地增加了鑒定的難度?？梢赃@樣講，棘口科吸蟲是吸蟲中最難準確鑒定的類群之一，然而分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。試驗以采自黑龍江省自然感染犬體小腸內(nèi)的兩種棘口吸蟲為研究對象，用PCR 方法擴增其核糖體DNA 中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列，并與GenBank 上公布的相關(guān)棘口吸蟲ITS 序列進行對比分析和進化分析，鑒定吸蟲的種類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源

蟲體來自黑龍江某地自然死亡的犬只，剖檢時在小腸內(nèi)檢出蟲體8 條，清洗后保存于70%的乙醇中，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗材料

顯微鏡，載玻片，蓋玻片，移液管，鑷子，挑針，DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），Ex Taq DNA 聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），r Taq DNA 聚合酶（TaKaRa），pMD18-T 載體（TaKaRa），大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞（TaKaRa），DNA Marker（2000），1×TAE，蛋白酶K，生理鹽水，75%乙醇，瓊脂糖，溴化乙錠，DNA 凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit），甘油，冰乙酸，去離子水等實驗常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)初步觀察

因犬死亡時間較長，送檢較晚，蟲體破損較為嚴重，無法制作裝片進行仔細觀察。于是將收集到的蟲體用蒸餾水反復(fù)洗滌后，直接置顯微鏡下進行觀察。依據(jù)蟲體大小和外部形態(tài)，初步斷定是兩種吸蟲，分別命名為吸蟲A 和吸蟲B。在不同倍數(shù)不斷調(diào)整蟲體位置來觀察蟲體外觀及內(nèi)部各器官的形態(tài)特征。

1.2.2 總DNA 提取

將兩種吸蟲清洗后，用TIANamp Genomic DNA Kit（TIANGEN）試劑盒嚴格按照說明書進行DNA 提取，提取后DNA 分裝置于－20 ℃冰箱中保存，用于下一步PCR 擴增。

1.2.3 目的基因的擴增

以兩種蟲體DNA 為模板，PCR 擴增蟲體ITS 序列，使用Gasser 等[11]設(shè)計的通用引物，上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由哈爾濱擎科生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，1 μL DNA 模板，2.5 μL Ex Taq Buffer，2 μL dNTP mixture，0.5 μL 引物和0.2 μL Ex Taq DNA 酶。具體的擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)：98 ℃變性30 s，退火溫度55 ℃30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴增出的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照。切下目的條帶后用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。然后將回收的DNA 產(chǎn)物連接到T-easy 載體上，經(jīng)過無抗LB 培養(yǎng)后，涂在AMP+的固體LB 培養(yǎng)基上，克隆所得陽性質(zhì)粒送到哈爾濱擎科科技有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析與進化關(guān)系分析

測序得到的序列經(jīng)拼接后，應(yīng)用DNAStar 軟件中的MegAlign 與棘口科的相關(guān)蟲體進行同源性分析。利用MEGA X 軟件，基于rDNA ITS2 序列，以肝片吸蟲為外群，采用最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）將研究的兩種蟲體與棘口科13 屬29 種吸蟲構(gòu)建進化樹，來探討這兩種吸蟲與其它棘口吸蟲之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體形態(tài)學(xué)初步觀察

吸蟲A：吸蟲A 一共5 條蟲體，蟲體扁平，外觀整體呈瓶狀，有口腹兩吸盤。體長1.03~1.04 mm，體最寬0.33~0.38 mm。有頭部24 棘，背部中間無棘，左右各12 枚?？谖P位于蟲體前端，腹吸盤位于蟲體前1/2 處。睪丸呈橢圓形，前后排列于蟲體后1/3 處。卵巢看不清楚。參照相關(guān)文獻[1]初步鑒定為棘口科棘隙屬吸蟲。

吸蟲B：吸蟲B 一共3 條蟲體，蟲體呈長葉形，有口腹兩吸盤。體長8.6~9.1 mm，體最寬1.2~1.3 mm。有頭棘27 枚，8 枚腹角棘平分，左右各4 枚?？谖P位于蟲體前端，腹吸盤在蟲體前1/5 處，大于口吸盤。睪丸呈類橢圓形，前后排列于蟲體中部。卵巢形狀不清，卵黃腺分布于蟲體兩側(cè)數(shù)量較多。參照相關(guān)文獻［1，9］初步鑒定為棘口科似頸屬吸蟲。

2.2 目的基因的擴增

成功擴增兩種蟲體的ITS 序列，分別在1 300 bp和1 000 bp 左右出現(xiàn)明顯條帶，大小在目的基因范圍之內(nèi)，條帶單一且明亮（圖1）。

圖1 兩種吸蟲ITS 序列的擴增結(jié)果Fig.1 The amplification of ITS sequence of two trematodes

2.3 序列分析與進化分析

經(jīng)鑒定的陽性質(zhì)粒送至哈爾濱擎科生物有限公司進行測序，拼接后得到長度分別為1 233 bp 和1 046 bp 的ITS 序列。吸蟲A 的ITS1 長度為386 bp，A+T 含量為49.48%，5.8 S 長度為156 bp，A+T 含量為45.51%，ITS2 長度為691 bp，A+T 含量為47.47%，ITS 全序列A+T 含量為47.85%。經(jīng)MegAlign 同源性序列分析比較發(fā)現(xiàn)，該蟲體與GenBank 上已經(jīng)發(fā)表棘口科冠孔屬（Stephanoprora）、棘口屬（Echinostoma）、棘緣屬（Echinoparyphium）、真緣屬（Euparyphium）和似頸屬（Isthmiophora） 的同源性較低，在76.4%~82.9%之間；與同屬蟲體同源性較高，與Echinochasmus coaxatus 同源性為96.4%，而與來自越南的日本棘隙吸蟲（KT873314.1）同源性高達99.5%。吸蟲B 的ITS1、5.8 S 和ITS2 的大小分別是444、162 bp 和440 bp，A+T 含量分別是46.62%、47.53%和50.00%，ITS 全序列A+T 含量為48.18%。同源性分析顯示與冠孔屬、棘緣屬、真緣屬和棘隙屬的同源性在74.9%~89.4%之間，與棘口屬的Echinostoma caproni 的同源性僅為84.8%，但與來自黑龍江淡水魚圓圃棘口吸蟲囊蚴（KX832896.1） 和來自日本浣熊的圓圃似頸吸蟲（AB189982.1）ITS2 序列同源性均為100%。

基于ITS2 序列，棘口科13 屬29 種吸蟲構(gòu)建的進化樹顯示，整個棘口科吸蟲形成兩個大的分支，棘隙屬蟲體與冠孔屬蟲體形成一個大分支，棘口屬及其它屬吸蟲形成另一大分支。在棘隙屬與冠孔屬這一大分支中，棘隙吸蟲又單獨形成一個小的分支，實驗吸蟲A 與來自越南的5 條日本棘隙吸蟲聚集在一起，親緣關(guān)系較另一種棘隙吸蟲（Echinochasmus coaxatus）近。值得注意的是，吸蟲B 并未與除圓圃棘口吸蟲外的其他棘口屬吸蟲聚集在一起，而是與圓圃棘口吸蟲、Isthmiophora hortensis 聚集在一起，與獾似頸吸蟲（Isthmiophora melis）形成一獨立分支（圖2）。

圖2 基于ITS2 序列構(gòu)建的進化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on ITS2 sequences

因此，基于序列分析和進化分析，鑒定兩種吸蟲分別為日本棘隙吸蟲和圓圃似頸吸蟲。

3 討論

日本棘隙吸蟲和圓圃似頸吸蟲感染的動物主要是犬和貓，因這些動物不是影響畜牧業(yè)經(jīng)濟的主要動物，所以人們關(guān)注和重視的程度不高。然而感染的犬和貓是人類感染的重要傳染源，在疫病的流行中起到非常重要的作用。人是因為食用生的或未煮熟的淡水魚和蛙類（蛙類僅為圓圃似頸吸蟲的中間宿主）而感染。目前，世界上很多國家有人感染的病例報道，如中國、韓國、日本、泰國、老撾、越南等[3-7，12-15]，可以看出這些國家主要集中在東南亞，這可能與人們的生活飲食習(xí)慣有關(guān)，這些地區(qū)的人們都吃生淡水魚的習(xí)慣。在我國，雖然同樣因吃生魚而感染華支睪吸蟲的患者廣泛分布于27 省區(qū)[16]，但日本棘隙吸蟲僅在福建、廣東、廣西、江蘇、安徽等地有人感染的報道[5，12，17-20]，圓圃似頸吸蟲僅在廣西、遼寧、貴州和黑龍江有報道[21-24]。分析可能是由于該蟲體寄生于小腸，蟲體較小，人體感染強度通常又比較低，癥狀比較輕微，而且很少有人在沒有寄生蟲感染跡象時進行寄生蟲蟲卵檢查，即使感染了，也很可能會被遺漏，估計實際感染的省份和病例遠不止這些。雖然在黑龍江省多地犬小腸內(nèi)檢出日本棘隙吸蟲[25]，同時在魚吸蟲囊蚴檢查時，也發(fā)現(xiàn)了大量日本棘隙吸蟲囊蚴，而且感染魚的種類多，地理分布較廣，黑龍江省卻還未見人感染的報道。盡管成年人少量感染棘口吸蟲不能造成直接死亡，但由于頭棘造成腸道損傷，易繼發(fā)細菌感染，再加之毒素作用，對人的危害也不容忽視。幼兒和兒童大量感染可產(chǎn)生嚴重后果，江蘇有一17 月齡患兒因寄生207 條日本棘隙吸蟲引起長期腹瀉，導(dǎo)致患兒重度營養(yǎng)不良并發(fā)念球菌感染，全身衰竭而死[19]。桂林也有一例5 歲男孩因大量感染日本棘口吸蟲而死亡的報道[17]。因此，建議對棘口吸蟲應(yīng)足夠重視，在條件允許情況下，對于有吃生魚蛙史的人們，特別是采取生吃泥鰍偏方治病者，應(yīng)定期進行糞便檢查，發(fā)現(xiàn)蟲卵，及時驅(qū)蟲，以保證身體健康。

由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的局限性，以核糖體和線粒體為標(biāo)記基因來鑒定蟲體得到了廣泛應(yīng)用。其中應(yīng)用最多的就是ITS 序列，ITS 序列是18S 和28S 之間的區(qū)域片段，包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2），核糖體DNA 中的ITS1 和ITS2片段是非編碼區(qū)，不轉(zhuǎn)錄成RNA，進化選擇壓力小，相對變化較大，在種間有較大的差異，所以可以作為鑒定近緣種與種群的系統(tǒng)進化關(guān)系的標(biāo)記基因[26]。Huang 等[27]在對來自不同地區(qū)的肝片吸蟲和大片吸蟲ITS 序列進行分析發(fā)現(xiàn)了一種介于兩者之間的“中間型”，目前“中間型”片形吸蟲已得到學(xué)術(shù)界的認可；高遠等[28]通過對鼻形杯環(huán)線蟲ITS 序列進行擴增和比對分析，準確地鑒定了該蟲體；羊仰口線蟲和牛仰口線蟲兩者形態(tài)比較相似，特別是雌蟲，為了從分子水平上鑒別兩種蟲體，Wang 等[29]使用限制性內(nèi)切酶Nde I 對兩種線蟲核糖體ITS 進行酶切，結(jié)果羊仰口線蟲被切成兩段，而牛仰口線蟲不變，建立了區(qū)分兩種線蟲的PCR-RFLP 方法。ITS 序列不僅可以鑒定成蟲，還可以鑒定吸蟲囊蚴，華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲囊蚴均寄生于魚的肌肉，形態(tài)十分相似，很難通過形態(tài)學(xué)加以區(qū)分，我們團隊以ITS 為標(biāo)記基因建立了區(qū)分兩種吸蟲囊蚴的PCR-RFLP 方法，并獲批了發(fā)明專利[30]。

日本棘隙吸蟲與藐小棘隙吸蟲等同屬的大部分吸蟲均為24 個頭棘，大小相似；圓圃似頸吸蟲和獾似頸吸蟲（Isthmiophora melis）、真緣屬的隱棘真緣吸蟲（Euparyphium inerme）均有27 枚頭棘，大小也差不多，形態(tài)學(xué)準確鑒定需要豐富的經(jīng)驗，難度較大，特別是當(dāng)蟲體形態(tài)受損時，形態(tài)觀察則更加困難，因此采取PCR 方法擴增了待檢蟲體的ITS 序列，并與相關(guān)序列比較分析，同時構(gòu)建了分子進化樹來鑒定這兩種蟲體。序列分析發(fā)現(xiàn)，吸蟲A 與GenBank 公布的日本棘隙吸蟲（KT873311.1）同源性為99.5%?；贗TS 序列構(gòu)建的棘口科吸蟲進化樹顯示，吸蟲A 與棘隙屬吸蟲一起，與冠孔屬吸蟲和棘隙屬處于一個大分支上。在棘隙屬吸蟲分支中，試驗蟲體與其來自越南的5 條日本棘隙吸蟲ITS 序列聚在一起，可以準確地鑒定該蟲體為日本棘隙吸蟲。關(guān)于圓圃似頸吸蟲的分類一直有爭議，該蟲體最初由日本學(xué)者在1926年發(fā)現(xiàn)并命名為圓圃棘口吸蟲[31]。2002 年，Kostadinova 和Gibson 在對似頸屬和真緣屬進行分類研究時，確定了這兩屬的有效性，并對相關(guān)蟲體進行重新分類。通過對圓圃棘口吸蟲的詳細觀察，認為該蟲體的子宮區(qū)域、睪丸位置，頭棘27 枚和不同種類棘的大小等特征更符合似頸屬特征，正式將其從棘口屬移至似頸屬，并將其重命名為圓圃似頸吸蟲（Isthmiophora hortensis）[32]，該種名已得到業(yè)界的認可，成為有效種。但我國有的學(xué)者還使用圓圃棘口吸蟲這一名稱[24，33]。研究的序列分析也發(fā)現(xiàn)，檢出的吸蟲B與棘口屬吸蟲Echinostoma caproni 的同源性僅為84.8%，而與獾似頸吸蟲同源性為95.4%，與圓圃似頸吸蟲和圓圃棘口吸蟲同源性為100%。進化分析顯示吸蟲B 沒有和棘口屬的吸蟲在一起，而是與圓圃似頸吸蟲處與同一分支。因此基于對吸蟲核糖體ITS序列的研究也支持圓圃棘口吸蟲應(yīng)為圓圃似頸吸蟲，研究所獲得來自于犬的蟲體為圓圃似頸吸蟲，以前我們團隊在GenBank 上公布的來自于犬的和魚囊蚴的相關(guān)序列應(yīng)為圓圃似頸吸蟲序列，同時建議以后學(xué)者在發(fā)表學(xué)術(shù)論文和學(xué)術(shù)交流時采用圓圃似頸吸蟲來代替圓圃棘口吸蟲這一名稱。研究再次證明了ITS 是寄生蟲分子鑒定的重要靶標(biāo)。