劉碩，王欣，李皖豫，馬駿，范釗偉，王然，段旭陽，周玉龍，朱戰(zhàn)波，崔玉東，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

奶牛乳腺炎主要是由細(xì)菌感染乳腺而引起，該病是影響世界各國奶牛業(yè)發(fā)展的最重要疾病之一，不僅給奶業(yè)和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還影響人類健康。引起奶牛乳腺感染的細(xì)菌種類繁多，主要有鏈球菌、葡萄球菌和腸道菌感染等[1]。鏈球菌中主要包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。其中在臨床病例樣本中，僅無乳鏈球菌的分離比率有時(shí)就可占到所有分離病原菌的38.61%[2-3]。以往對(duì)鏈球菌引起的奶牛乳腺炎主要使用抗生素預(yù)防和治療，但隨著抗生素的長期、大量使用，鏈球菌的耐藥性日益嚴(yán)重，耐藥菌株大量增加[4]。于是，研究和使用疫苗預(yù)防鏈球菌引起的奶牛乳腺炎備受重視。在上個(gè)世紀(jì)70 年代，人們就研究了用自家菌苗預(yù)防無乳鏈球菌感染奶牛乳腺，但免疫保護(hù)效果不理想[5]。2002 年Fontaine MC 等[6]研究了乳房鏈球菌和無乳鏈球菌表面關(guān)聯(lián)的GapC 重組蛋白或嵌合CAMP-3蛋白免疫接種奶牛，證明了GapC 比CAMP-3 誘導(dǎo)更明顯的抗病原攻擊的免疫保護(hù)作用。隨后，Bolton A等[7]用停乳鏈球菌表面蛋白GapC 和Mig 重組蛋白分別免疫牛，證明GapC 和Mig 免疫牛均能明顯降低乳中體細(xì)胞數(shù)，且GapC 較Mig 免疫牛的乳區(qū)感染數(shù)明顯降低。

鏈球菌GapC 是具有GAPDH 酶活性的保守性蛋白，且可能與其粘附和感染有關(guān)[8]。通過基因序列分析可知，無乳鏈球菌GapC 與停乳鏈球菌、乳房鏈球菌的GapC 的核苷酸序列具有高度的同源性分別[9]。課題組用奶牛乳房炎無乳鏈球菌GapC、停乳鏈球菌GapC、乳房鏈球菌GapC 的重組蛋白分別免疫小鼠，證明該蛋白具有良好的交叉免疫保護(hù)作用，即一個(gè)GapC 免疫可使小鼠獲得對(duì)無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌三種菌的抗感染免疫保護(hù)作用[10]。進(jìn)一步研究證實(shí)GapC1-150能誘導(dǎo)與GapC 全蛋白一致的免疫保護(hù)作用[11]。目前，由鏈球菌GapC1-150重組蛋白構(gòu)建的融合蛋白GIT 作為預(yù)防鏈球菌性奶牛乳房炎的候選疫苗正在進(jìn)行奶牛臨床試驗(yàn)，但對(duì)該疫苗免疫接種奶牛產(chǎn)生的抗體缺少檢測(cè)方法，無法有效地評(píng)價(jià)GIT 抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。

臨床上用于抗體水平檢測(cè)的方法有凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、中和試驗(yàn)以及ELISA 標(biāo)記抗體等檢測(cè)方法[12]，而其中間接ELISA 檢測(cè)方法具有特異性好、靈敏性高、簡便快捷、適于大規(guī)模和定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。因而，實(shí)驗(yàn)擬選擇重組無乳鏈球菌GapC1-150蛋白作為抗原，建立血清抗體間接ELISA 檢測(cè)方法。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和血清

無乳鏈球菌HLJ57 株，為實(shí)驗(yàn)室分離于患奶牛乳房炎牛乳汁、經(jīng)鑒定保存的菌株；大腸桿菌BL21（de3） 株為實(shí)驗(yàn)室保存菌株；質(zhì)粒pET32a、質(zhì)粒pGEX-6p-1 為實(shí)驗(yàn)室保存；金黃色葡萄球菌Wood46株血清、金黃色葡萄球菌重組IsdB、Trap、pET32a 標(biāo)簽蛋白以及含有鏈球菌GapC1-150片段的GIT 融合蛋白血清由實(shí)驗(yàn)室制備保存；牛布氏桿菌病陽性血清、牛副結(jié)核陽性血清和大腸桿菌腹瀉牛血清以及待檢牛血清樣本由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

預(yù)染彩虹蛋白Marker 購自Thermo 公司；Hisbinding-resin 蛋白純化柱、GST·bind 樹脂為上海點(diǎn)創(chuàng)生物科技有限公司、Super-Bradford 蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自北京Solarbio 公司；小鼠抗GST Taq 抗體購自Proteintech 公司、小鼠抗His Taq 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗牛IgG 購自北京博奧森有限公司；NC 膜、TMB 顯色液購自北京Solarbio 公司。Luminata Crescendo Western HRP substrate 購自哈爾濱納川有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組無乳鏈球菌CapC1-150的表達(dá)、鑒定和純化

使用上游引物5′-CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3′、下游引物5′-CACAAGCTTAGCACCTGAGATAACTGTT-3′，以無乳鏈球菌基因組提取物為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得的CapC1-150基因片段分別與pET32a 質(zhì)粒和pGEX-6P-1 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定正確后，在含有氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中加終濃度0.1 mM 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE 分析。同時(shí)，將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用抗標(biāo)簽抗體作為第一抗體，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體作為第二抗體，進(jìn)行Western-blot 鑒定。用His-binding-resin 蛋白純化柱純化由pET32a 載體表達(dá)的CapC1-150蛋白（簡稱eCapC1-150）及pET32a 標(biāo)簽蛋白，用GST·bind樹脂純化pGEX-6p-1 載體表達(dá)的GapC1-150蛋白（簡稱gCapC1-150）。由eCapC1-150蛋白和標(biāo)簽蛋白pET32a用于疫接種奶牛制備血清；由gCapC1-150蛋白作為間接ELISA 檢測(cè)抗原。

1.2.2 抗原免疫血清制備

選擇6~18 月齡的健康Holstein 育成牛，用e－CapC1-150蛋白、pET32a 標(biāo)簽蛋白和培養(yǎng)7 h 的福爾馬林滅活的無乳鏈球菌HLJ57 分別與弗氏完全佐劑按體積比1∶1 比例乳化后，采用脖頸部肌肉或臀部肌肉注射方式，每頭牛注射蛋白抗原1.5 mg 或全菌體3×1010cfu。初次免疫后3 周，以等量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后再次免疫接種牛。同時(shí)以PBS 與佐劑乳化后免疫牛，用于制備對(duì)照血清。于二次免疫10 d 后尾靜脈采血，制備血清。

1.2.3 間接ELISA 操作程序

間接ELISA 操作的具體操作步驟[13]，先將抗原用包被液稀釋后進(jìn)行包被，再用封閉液封閉，然后加入待檢血清，孵育后加入酶標(biāo)二抗，最后加入酶底物、終止液，測(cè)定OD450值。 每個(gè)步驟之間均用洗滌液洗滌3 次，每次洗滌4 min。每種試劑均加入每空100 μL。在OD450值陽性與陰性比值（P/N）大于2.1 以上、且最大者的反應(yīng)條件作為確定ELISA 最佳反應(yīng)條件的判定依據(jù)。

1.2.4 抗原、血清最佳稀釋濃度確定

將gGapC1-150蛋白作為抗原，以包被緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，分別稀釋成5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1；抗原eCapC1-150陽性血清和對(duì)照牛血清以樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，分別稀釋成1/500、1/1 000、1/2 000 、1/4 000。

1.2.5 間接ELISA 條件的優(yōu)化

以最佳抗原濃度進(jìn)行包被，分別用包被液碳酸鹽緩沖液CBS（pH 9.6）、Tris 鹽緩沖液TBS（pH 8.6）、磷酸鹽緩沖液PBS（pH 7.4）、PBS 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）、檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）、水（pH 7.0）稀釋抗原蛋白，包被時(shí)間暫為37 ℃2 h；確定包被液后，再以最佳包被液于4 ℃過夜、4 ℃過夜加37 ℃1 h、37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃45 min、37 ℃30 min 進(jìn)行包被。在以上優(yōu)化基礎(chǔ)上，優(yōu)化不同封閉液，所用封閉液分別為1%BSA、5%脫脂乳、1%BSA+5%蔗糖、1%BSA+0.05%Tween20、5%脫脂乳+0.05%Tween20、5%胎牛血清、1%明膠，封閉時(shí)間暫為37 ℃2 h；封閉液確定后再優(yōu)化封閉條件，分別以37 ℃2 h、37 ℃1.5 h、37 ℃1 h、37 ℃45 min、37 ℃30 min、37 ℃15 min 封閉。在以上優(yōu)化反應(yīng)條件完成后，反應(yīng)體系分別加入陰、陽性血清進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為15、30、45 min，1、1.5、2 h。

1.2.6 Cut-off 值確定

取陰性對(duì)照牛血清52 份、GIT 免疫牛血清17 份，用優(yōu)化后的條件進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，每一個(gè)樣品重復(fù)3 次，求得兩類血清的OD450平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。對(duì)陰性血清與免疫血清OD450值進(jìn)行正態(tài)分布和ROC曲線分析后，根據(jù)cut-off 值定值原則進(jìn)行確定[14]。

1.2.7 特異性與敏感性確定

用優(yōu)化后的間接ELISA 方法分別對(duì)GIT、IsdB、Trap、pET32a 和金葡菌Wood46、無乳鏈球菌HLJ57免疫牛血清以及大腸桿菌腹瀉牛血清、牛副結(jié)核陽性血清、牛布氏桿菌陽性血清等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)確定的cut-off 判定結(jié)果，以評(píng)估該方法的特異性。

將陽性與陰性血清進(jìn)行平行倍比稀釋至1∶128 000，同時(shí)用緩沖液PBS 作為空白對(duì)照組。以P/N＞2.1 的最大稀釋度來判定間接ELISA 方法的敏感性[15]；當(dāng)OD450值小于cut-off 值的稀釋度為該ELISA方法的最低檢測(cè)水平[16]。

1.2.8 穩(wěn)定性檢測(cè)

用同一次純化的gGapC1-150抗原包被酶標(biāo)板，在3 個(gè)不同的時(shí)間內(nèi)測(cè)定6 份不同的血清（每份血清6次重復(fù)），并計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)，確定批內(nèi)穩(wěn)定性；用不同次純化的抗原包被3 塊不同批次酶標(biāo)板，在相同的時(shí)間測(cè)定6 份不同的血清（每份血清6 次重復(fù)），并計(jì)算批間變異系數(shù)，確定批間穩(wěn)定性。

1.2.9 臨床樣品檢測(cè)

用建立的間接ELISA 方法檢測(cè)待檢牛血清85份。其中，待檢牛血清樣本來源于雞西某牛場19 份，虎林某牛場15 份，北安某牛場12 份，明水某牛場26份，阿榮旗某牛場13 份。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理分析

用EXCEL2003 和SPSS Statistics 17.0 軟件處理、分析數(shù)據(jù)，用Origin2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組GapC1-150 蛋白的表達(dá)、鑒定及純化

從S.agalactiae HLJ57 菌株P(guān)CR 擴(kuò)增獲得的gapC1-150基因，與GenBank 中的基因序列（GI：21666-598）進(jìn)行比較，結(jié)果同源性為100%。用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，重組蛋白eCapC1-150和gGapC1-150分別在36、44 KDa 處出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，并分別用抗His-tag、抗GST 抗體進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證；重組蛋白eCapC1-150存在于菌體破碎后的上清和沉淀中；而重組gGapC1-150主要存在于菌體破碎后的沉淀中，且兩個(gè)重組蛋白均得到較好純化。結(jié)果詳見圖1（A-D）。

2.2 最佳包被抗原濃度與血清的稀釋度確定

用方陣法以不同濃度的包被抗原與不同稀釋度的陰、陽血清做間接ELISA，測(cè)定OD450值，求P/N值。當(dāng)抗原包被濃度為2.5 μg·mL-1、血清稀釋1/1 000時(shí)，P/N 值最大。結(jié)果詳見表1。

圖1 重組蛋白GapC1-150 表達(dá)、鑒定及純化Fig.1 Expression，identification and purification of the recombinant GapC1-150

表1 包被抗原濃度與血清稀釋度滴定（P/N）Table 1 Titration of coated antigen concentration and serum dilution（P/N）

2.3 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化

經(jīng)間接ELISA 檢測(cè)，6 種包被液中，PBS（pH7.2）的P/N 值最大；包被時(shí)間為37 ℃45 min 時(shí)P/N 值最大；7 種封閉液中，1% BSA（PBST）的P/N 值最大，封閉時(shí)間以37 ℃1.5 h 時(shí)P/N 值最大；抗原與血清孵育時(shí)間以37 ℃30 min 時(shí)P/N 值最大。以上結(jié)果確定為間接ELISA 最佳反應(yīng)條件。

2.4 Cut-off 值確定

對(duì)52 份陰性牛血清和17 份GIT 免疫血清的OD450值正態(tài)分布和ROC 曲線分析，兩組血清OD450值均符合正態(tài)分布，且置信區(qū)間大于95%，陰性牛血清與GIT 免疫血清OD450值不發(fā)生重疊，因此以2 倍的陰性血清OD450平均值作為cut-off 值，即平均值0.231 9，cut-off 值為0.464。結(jié)果詳見如圖2、3。

2.5 特異性與敏感性確定

用建立的ELISA 檢測(cè)方法分別對(duì)重組eGapC1-150、GIT、IsdB、Trap、pET32a、金葡菌Wood46、無乳鏈球菌HLJ57、大腸桿菌腹瀉牛血清、牛副結(jié)核陽性血清、牛布氏桿菌陽性血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，gGapC1-150作為包被抗原所建立的間接ELISA 檢測(cè)方法，檢測(cè)到eGapC1-150蛋白免疫血清、GIT 免疫血清陽性，其他血清均呈陰性，說明與其他血清無交叉反應(yīng)。結(jié)果詳見圖4。

圖2 對(duì)照血清、免疫血清用ELISA 進(jìn)行評(píng)估Fig.2 Evaluation of the control serum and immune serum using ELISA

圖3 ELISA 的cut-off 值確定Fig.3 Determination of cut-off value of ELISA

圖4 ELISA 的交叉反應(yīng)性Fig.4 Cross reactivity of ELISA

將陽性血清、陰性血清分別倍比稀釋至1∶128 000倍，進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示，該ELISA 方法的敏感度為1∶16 000；最低可檢測(cè)血清稀釋度1∶64 000，且當(dāng)血清稀釋度為1∶1 000 時(shí)，陰性值剛好低于cutoff 值，也進(jìn)一步說明了最佳血清稀釋度的準(zhǔn)確性。結(jié)果如圖5。

圖5 ELISA 檢測(cè)的最低血清稀釋度Fig.5 The minimum detection limit of ELISA

2.6 穩(wěn)定性確定

用同批次抗原和試劑在3 個(gè)不同的時(shí)間內(nèi)對(duì)6份不同的血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，其批內(nèi)變異系數(shù)在3.6%~9.6%之間；用不同批次抗原和試劑同時(shí)對(duì)6 份不同的血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，其批間變異系數(shù)在1.59%~9.81%之間。變異系數(shù)均小于10%，說明該ELISA 法穩(wěn)定性良好。

2.7 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法85 份待檢牛血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果待檢牛血清陽性檢出率為12.94%。

3 討論

臨床上用于檢測(cè)血清抗體水平的方法有抗原凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、中和試驗(yàn)以及ELISA 標(biāo)記抗體等檢測(cè)方法[12]，其中間接ELISA 檢測(cè)方法由于具有特異性好、靈敏性高、簡便快捷、適于定量和大規(guī)模檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)及疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期研究的含有鏈球菌GapC1-150的融合蛋白疫苗臨床免疫奶牛后檢測(cè)抗體水平需要，實(shí)驗(yàn)建立了以gGapC1-150作為包被抗原的間接ELISA檢測(cè)方法，通過對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性、敏感性等研究，證明所建立的間接ELISA 方法，具有較好的特異性和敏感性。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，我們使用eGapC1-150免疫奶牛制備陽性血清。為了避免標(biāo)簽蛋白pET32a 在檢測(cè)時(shí)可能帶來的交叉反應(yīng)，選用pGEX-6p-1 載體表達(dá)的GapC1-150作為檢測(cè)抗原，對(duì)eGapC1-150免疫血清和GIT 免疫血清檢測(cè)均呈陽性，而與pET32a 免疫血清和其他pET32a 表達(dá)抗原的免疫血清均呈陰性，說明很好地避免了表達(dá)標(biāo)簽蛋白的交叉反應(yīng)。但對(duì)兩次滅活無乳鏈球菌HLJ57 免疫血清檢測(cè)為陰性，可能與GapC 在細(xì)菌中的表達(dá)量占菌體全蛋白量過低所造成的；另外，對(duì)3 份金黃色葡萄球菌的Trap 抗原免疫血檢測(cè)的OD450值則與Cut-off 值相近，且有1 份血清的OD450值高于Cut-off 值，其原因有待于進(jìn)一步研究。

在使用52 份陰性牛血清、17 份GIT 免疫牛血清檢測(cè)確定cut-off 值時(shí)，我們經(jīng)過SPSS 軟件分析對(duì)照血清及GIT 免疫血清均符合正態(tài)分布，且置信區(qū)間大于95%，通過Origin 軟件對(duì)對(duì)照血清、免疫血清多因子柱狀圖2 可知，對(duì)照血清與GIT 免疫血清之間不交叉，故此cut-off 值采用傳統(tǒng)定值法即cutoff 等于2X（對(duì)照樣品平均值），即0.464。根據(jù)ROC曲線分析和特異性、敏感性檢測(cè)，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性好。有研究者[17-18]在建立間接ELISA 檢測(cè)方法時(shí)，先對(duì)陰性血清進(jìn)行篩查，剔除OD450值偏高的血清，然后再對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)，確定Cut-off 值。在沒有確定是由感染造成的情況下，如果是牛個(gè)體差異或一些非特異性因素造成的，還是應(yīng)該把這份血清納入統(tǒng)計(jì)計(jì)算之中，這樣得出cut-off 值可能更符合實(shí)際。但實(shí)驗(yàn)的陰性牛血清和免疫牛血清樣本數(shù)較小，有待于在今后臨床檢測(cè)中對(duì)結(jié)論作進(jìn)一步補(bǔ)充、修正。

用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法對(duì)85 頭待檢牛血清樣本中，檢出了11 頭陽性牛，但對(duì)于這些血清樣本來源的奶牛具體情況不夠了解，無法查清陽性結(jié)果的原因[19-20]。由于對(duì)GapC450免疫血清尚缺少可參考的檢測(cè)方法，無法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核[21-23]，如果能夠再進(jìn)一步開展研究的話，應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)牛的來源、健康狀況進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查和嚴(yán)格檢查，在實(shí)驗(yàn)造作的各個(gè)環(huán)節(jié)都做到確實(shí)可靠；或者建立探討其他檢測(cè)方法進(jìn)行比較檢測(cè)，從而時(shí)所建立的方法在實(shí)踐應(yīng)用中達(dá)到理想效果。

4 結(jié)論

用表達(dá)的重組蛋白gGapC1-150作為檢測(cè)抗原，建立了間接ELISA 血清學(xué)檢測(cè)方法，通過反應(yīng)條件優(yōu)化、交叉血清反應(yīng)檢測(cè)、陽性血清不同稀釋度測(cè)定以及對(duì)GapC1-150融合蛋白GIT 疫苗免疫牛血清檢測(cè)等證明，所建立的間接ELISA 牛血清GapC1-150抗體檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性良好，適于含鏈球菌GapC1-150片段的GIT 疫苗免疫牛血清檢測(cè)。