曹玉敏 郭凡凡 王 芳 張 熠 陳友國

卵巢癌是第三大常見的婦科腫瘤,致死率很高[1]。其標(biāo)準(zhǔn)化療方案以鉑為基礎(chǔ),鉑類等DNA損傷藥物與DNA結(jié)合,形成單加合物來發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[2,3]。盡管卵巢癌對鉑類化療的初始反應(yīng)高達(dá)80%,但在大多數(shù)患者中,獲得性耐藥最終會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡。卵巢癌對化療抵抗的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,DNA損傷修復(fù)是其中之一[2]。

同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HRR)是一種精確的修復(fù)DNA雙鏈斷裂(double strand breaks, DSB)的途徑[4]。CtIP負(fù)責(zé)DNA切除,RAD51被招募到DSB位點(diǎn),允許DNA入侵同源雙螺旋[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道CtIP為p38α底物,因此,p38α的降低能導(dǎo)致HRR受損,同時(shí)復(fù)制應(yīng)激、DNA損傷和染色體不穩(wěn)定增加,導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[6]。

馬里苷是金雞菊中提取的黃酮類活性成分[7]。近年來,關(guān)于馬里苷在抗氧化,調(diào)節(jié)糖脂答謝方面的作用多有報(bào)道,然而鮮有其在抗癌方面的相關(guān)研究[8～11]。為了探究馬里苷在抗腫瘤方面的潛在作用,筆者對于通過計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測了馬里苷可能的結(jié)合靶點(diǎn),對于馬里苷能否通過靶向p38α抑制HRR,從而對DNA損傷藥物有增敏作用作出如下研究。

材料與方法

1.細(xì)胞株及主要試劑、儀器:人卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3、A2780均購自美國ATCC公司。RPMI1640、DMEM、胎牛血清(FBS)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)均購自美國Gibco公司。雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.25%胰酶消化液均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。馬里苷、卡鉑、喜樹堿均購自中國中楚致遠(yuǎn)科技有限公司。2-(2-甲氧基 -4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(CCK-8)購自中國科尤博生物科技公司。二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。Comet Assay試劑盒購自美國R&D Systems公司。p-p38α抗體、GAPDH抗體、γ-H2AX 抗體、RAD51抗體均購自美國CST公司。p38α抗體購自英國Abcam公司。CtIP抗體購自美國SANTA公司。鼠源、兔源二抗購自中國翊圣生物科技公司。pCBASceI質(zhì)粒、pDRGFP均購自美國Addgene公司。酶標(biāo)儀Labserv K3型購自美國Thermo Fisher公司。Western blot法檢測所需儀器購自美國Bio-Rad公司,流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,A2780分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100U/ml雙抗(青霉素+鏈霉素)的RPMI1640和DMEM高糖培養(yǎng)基中;置于37℃、5% CO2溫育箱中。(2)CCK-8實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期的SKOV3或A2780細(xì)胞,以5000個(gè)/(100微升·孔)接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,分別設(shè)立單用卡鉑、喜樹堿組和卡鉑/馬里苷、喜樹堿/馬里苷聯(lián)用組,作用72h后,吸出上清,每孔加入90μl培養(yǎng)基和10μl CCK-8試劑,培養(yǎng)1h后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上450nm波長下測量樣品吸光度(A)值。(3)克隆集落形成實(shí)驗(yàn):取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,分別設(shè)立單用卡鉑、喜樹堿、馬里苷組和卡鉑/馬里苷、喜樹堿/馬里苷聯(lián)用組,預(yù)處理48h后以每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)10天。棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌兩遍,加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min,棄去多聚甲醛,用PBS洗滌兩遍;加入結(jié)晶紫室溫靜置30min,使用PBS洗滌兩遍,晾干,拍照。(4)Western blot法檢測:提取細(xì)胞總蛋白。設(shè)立空白對照組、單用甲磺酸甲酯、喜樹堿組和甲磺酸甲酯/馬里苷、喜樹堿/馬里苷聯(lián)用組,經(jīng)SDSPAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗4℃孵育過夜,TBST漂洗3次,加入二抗孵育2h,TBST漂洗3次。美國LICOR公司Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影。(5)免疫熒光實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞以每孔5000個(gè)接種于24孔板,貼壁后,設(shè)立空白對照組、單用喜樹堿組和喜樹堿/馬里苷聯(lián)用組,收板時(shí),PBS洗滌3遍,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min,PBS洗滌3遍,0.1% Triton打孔30min,5%BSA封閉2h后,一抗4℃孵育過夜。次日,PBS洗滌3遍,孵育二抗室溫2h,PBS洗滌3遍,DAPI染色,PBS洗滌3 遍,封片,4℃保存,使用共聚焦顯微鏡拍攝。(6)彗星實(shí)驗(yàn):設(shè)立空白對照組、單用甲磺酸甲酯、馬里苷組和甲磺酸甲酯/馬里苷聯(lián)用組,以1×105/ml懸浮于PBS中,以1∶10的比例與瓊脂糖混勻后,取細(xì)胞懸液50μl滴于玻片上,隨后進(jìn)行固化、裂解、解旋、電泳,取出玻片滴加染色液,共聚焦顯微鏡下觀察,測量拖尾長度。(7)HRR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):設(shè)立對照組和馬里苷組,使用pDRGFP和pCBASceI質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染48h后,用流式細(xì)胞儀確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP陽性細(xì)胞的百分比。(8)類器官藥敏實(shí)驗(yàn):類器官接種。待生長良好后,設(shè)立單用卡鉑組和卡鉑/馬里苷聯(lián)用組培養(yǎng)4天。加入30μl發(fā)光試劑室溫振蕩2min,孵育8min。使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。(9)細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):提取蛋白。將上清蛋白等分為2管,分別加入等體積的DMSO和馬里苷,孵育2h。將每組蛋白平分至離心管中,分別加熱至41、46、51、56、61、66℃,加熱樣品3min,室溫冷卻3min,置于冰上。蛋白變性,后續(xù)用Western blot法檢測。(10)藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性技術(shù):提蛋白上清,按比例加入10×TNC緩沖液于蛋白上清液中。將上清均分加入等體積的DMSO和馬里苷,孵育1h。用TNC緩沖液將蛋白酶稀釋成適當(dāng)濃度,再依次稀釋成不同比例的鏈酶儲(chǔ)存液,根據(jù)蛋白酶與裂解液中總蛋白的比例加入蛋白酶,室溫孵育30min,加蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)。煮沸,-20℃儲(chǔ)藏備用,用于后續(xù)Western blot法檢測。

結(jié) 果

1.馬里苷增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對DNA損傷藥物的敏感度:使用SKOV3和A2780進(jìn)行試驗(yàn),分別給予卡鉑和喜樹堿這兩種已知的能夠引起DNA損傷的藥物進(jìn)行處理,并聯(lián)合使用馬里苷觀察療效。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,加入馬里苷能夠增強(qiáng)細(xì)胞對卡鉑與喜樹堿的敏感度(圖1中A～D)?？寺〖湫纬蓪?shí)驗(yàn)也證實(shí)了聯(lián)合使用馬里苷,能進(jìn)一步降低癌細(xì)胞的增殖能力(圖1中E和F)。

圖1 馬里苷增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對DNA雙鏈損傷藥物的敏感度

2.馬里苷增加卵巢癌細(xì)胞的DNA雙鏈損傷:已知甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)是一種經(jīng)典的能引起DSB的藥物,接下來使用MMS和喜樹堿來對細(xì)胞分別進(jìn)行誘導(dǎo),Western blot法檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,馬里苷能使DNA損傷標(biāo)志物γH2AX增加(圖2中A～C)。彗星實(shí)驗(yàn)也表明,使用馬里苷能夠增加細(xì)胞的拖尾(圖2中D、E)。以上結(jié)果共同證明了馬里苷能增加細(xì)胞的DNA損傷。

圖2 馬里苷增加卵巢癌細(xì)胞的DNA雙鏈損傷

3.馬里苷通過抑制p38α來抑制同源重組修復(fù):已有文獻(xiàn)報(bào)道,p38α能通過磷酸化DNA末端切除因子CtIP來促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[6]。為了進(jìn)一步研究馬里苷的作用機(jī)制,采用MMS和喜樹堿分別誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DSB,并探究馬里苷能否進(jìn)一步抑制細(xì)胞進(jìn)行HRR。Western blot法檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),馬里苷能夠抑制p38α的磷酸化功能,降低CtIP的表達(dá)。已知Rad51是HRR途徑中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白,Western blot法檢測顯示,馬里苷能夠降低Rad51的水平(圖中3A～D)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了馬里苷能夠增加γH2AX的表達(dá),降低Rad51的表達(dá)(圖3中E～H)。接下來采用HRR基因報(bào)告,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,馬里苷能抑制HRR(圖3中I、J)。綜上所述,馬里苷能夠靶向p38α抑制腫瘤細(xì)胞的HR能力。

圖3 馬里苷通過抑制p38α來抑制同源重組修復(fù)

4.馬里苷能增強(qiáng)卵巢癌類器官對卡鉑的敏感度:為了進(jìn)一步探究馬里苷能否增強(qiáng)對DNA損傷藥物的敏感度,筆者選取了鉑耐藥的類器官進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。類器官實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,馬里苷能夠增強(qiáng)卵巢癌類器官對卡鉑治療的敏感度,聯(lián)合使用馬里苷后,類器官發(fā)生破裂(圖4)。

圖4 馬里苷能增強(qiáng)卵巢癌類器官對卡鉑的敏感度

5.馬里苷通過與p38α結(jié)合發(fā)揮功能:為了探究馬里苷是否通過與p38α相結(jié)合發(fā)揮作用。采用計(jì)算機(jī)模擬將馬里苷與p38α進(jìn)行分子對接,發(fā)現(xiàn)馬里苷與p38α以LYS-53和MET-109相結(jié)合(圖5中A、B)。接下來進(jìn)行了細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,馬里苷能與p38α相結(jié)合(圖5中C、D)。此外,藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了此觀點(diǎn)(圖5中E、F)。

圖5 馬里苷通過與p38α結(jié)合發(fā)揮功能

討 論

卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)的一線治療是手術(shù)治療和以鉑為基礎(chǔ)的化療。然而在這樣的治療之下仍有80%的患者復(fù)發(fā)和死亡。鉑耐藥的出現(xiàn)可能是由于細(xì)胞內(nèi)藥物積累減少、DNA修復(fù)增加或凋亡信號通路受損。因此使用馬里苷組合策略靶向DNA修復(fù)途徑從而克服DNA損傷藥物的耐藥是我們想要探究的問題[12,13]。

DSB對基因組完整性和細(xì)胞存活構(gòu)成嚴(yán)重威脅[14,15]。HRR是一種精準(zhǔn)的應(yīng)對DSB的修復(fù)方式[16,17]。HRR在許多腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中至關(guān)重要,DNA末端切除因子CtIP和Rad51重組酶是HRR途徑的關(guān)鍵效應(yīng)器,是鉑耐藥性的決定因素[18～20]。因此需探究馬里苷能否抑制HRR途徑阻礙卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

由于p38α在維持基因組穩(wěn)定性和使癌細(xì)胞存活方面的重要作用, p38α可以直接磷酸化DNA修復(fù)調(diào)節(jié)劑,如CtIP[21～24]。既往研究報(bào)道,鉑類藥物和p38α抑制劑的組合會(huì)大大降低腫瘤生長[25]。這表明鉑類藥物的抗腫瘤作用可能受到p38α信號的調(diào)節(jié)。

通過計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測到p38α是馬里苷的潛在靶點(diǎn),對于馬里苷能否靶向p38α,抑制卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行HRR,從而能夠?qū)︺K類,喜樹堿等DNA損傷藥物有增敏的作用。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬里苷能夠增加對鉑類,喜樹堿等DNA損傷藥物的增敏作用,抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力,其作用機(jī)制是通過抑制p38α的磷酸化,增加卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷,使γH2AX增加,彗星拖尾增加。同時(shí)抑制HRR途徑中關(guān)鍵蛋白CtIP和Rad51的表達(dá),抑制卵巢癌細(xì)胞的修復(fù)效率。接下來通過計(jì)算機(jī)模擬的方法加以一系列結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了馬里苷與p38α的結(jié)合,此外馬里苷還能夠增加卵巢癌類器官對卡鉑的敏感度。說明馬里苷能夠靶向p38α,抑制HRR。因此,馬里苷聯(lián)合DNA損傷藥物治療卵巢癌有助于避免獲得性耐藥的發(fā)生。接下來會(huì)繼續(xù)收集各種癌癥患者組織,構(gòu)建類器官模型,以此來評估馬里苷作為新型HRR抑制劑的可能性和重要性,這項(xiàng)研究將幫助我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)作為新型HRR抑制劑的天然單體化合物,為馬里苷的藥理學(xué)研究提供新的思路,為卵巢癌臨床治療新策略提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。