申開文 張瑞波 王 強 岑威虎 沈 俊

腎缺血再灌注損傷是一種常見的臨床并發(fā)癥,缺血導致細胞內(nèi)三磷酸腺苷減少,細胞膜上鈉鉀交換功能下降,最終引起細胞水腫及細胞損傷。再灌注后,增加的活性氧(reactive oxygen species,ROS)會導致細胞再次損傷,受損細胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)刺激機體細胞分泌促炎和趨化細胞因子,進一步加重細胞損傷。缺血和再灌注兩個過程均導致腎小管細胞損傷、腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)降低,并最終導致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)[1]。AKI是一種全球常見的疾病,有著較高的發(fā)生率和病死率[2]。細胞焦亡作為程序性細胞死亡的一種形式,Gasdermin D(GSDMD)是細胞焦亡的關(guān)鍵效應物,它的主要作用是在胞膜上形成孔隙,最終導致細胞腫脹、膜溶解和炎性細胞因子釋放,眾多的研究表明,GSDMD介導的細胞焦亡是RIRI的一個重要過程[3]。本文通過總結(jié)國內(nèi)外最新文獻論述,對細胞焦亡的發(fā)生機制,細胞焦亡在RIRI中的作用及臨床應用潛力做一闡述。

一、細胞焦亡定義及其途徑

1.細胞焦亡定義:細胞焦亡這個定義最早提出是在2001年,被稱作是伴有炎性反應的程序性細胞死亡。在不斷對細胞焦亡研究中,目前細胞焦亡的定義是由某些炎性小體觸發(fā)的依賴GSDMD的一種炎癥性程序性細胞死亡形式,具體過程表現(xiàn)為炎性小體使caspase蛋白激活,caspase蛋白激活后可加工和激活I(lǐng)L-1β和 IL-18,同時還切割GSDMD以釋放膜孔形成GSDMD-N結(jié)構(gòu)域。GSDMD蛋白的N端結(jié)構(gòu)域在細胞膜上形成孔洞,誘導細胞膜破裂及IL-1β和 IL-18炎性細胞因子釋放[4]。

2.細胞焦亡途徑

(1)細胞焦亡經(jīng)典途徑:經(jīng)典途徑是指NLRP3等炎性小體通過誘導caspase-1的激活觸發(fā)細胞焦亡。該途徑主要通過DAMP或病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)與模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)的結(jié)合而啟動,然后PRR可以募集凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和pro-caspase-1以形成炎性小體。這些炎性小體募集并結(jié)合到ASC,導致ASC聚焦并激活caspase-1。caspase-1參與pro-IL-18 和pro-IL-1β的切割和成熟,同時切割GSDMD產(chǎn)生N和C末端。GSDMD的N末端片段(GSDMD-NT)釋放并在質(zhì)膜中形成孔隙,導致炎性細胞因子的分泌和水分子流入,產(chǎn)生細胞腫脹和滲透性裂解。最終誘導細胞焦亡和細胞內(nèi)物質(zhì)的分泌,釋放的細胞因子和DAMP會引發(fā)炎癥和隨后的免疫反應[5]。NLRP3激活后,通過其pyrin結(jié)構(gòu)域,ASC與傳感器分子相互作用,胱天蛋白酶募集域蛋白(caspase recruitment domain containing protein,CARD)結(jié)構(gòu)域與pro-caspase-1相互作用,使pro-caspase-1自切割形成caspase-1成熟體。一方面,活化的caspase-1識別無活性的IL-1β和IL-18前體,并將它們轉(zhuǎn)化為成熟的炎性細胞因子。另一方面,caspase-1切割GSDMD并寡聚化介導膜孔形成的31kDa氨基末端產(chǎn)物(GSDMD-N)。膜孔形成,細胞腫脹,炎性細胞因子的釋放,最終導致細胞焦亡[6,7]。

(2)細胞焦亡的非經(jīng)典途徑:非經(jīng)典途徑誘導的焦亡是對革蘭陰性菌的一種獨特的免疫反應。它是由G-細菌表面的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導產(chǎn)生,激活了caspase-4/5/11,而caspase-4/5/11又激活了一系列下游蛋白,最終在細胞膜上形成蛋白孔,并誘導細胞裂解過程[8]。非典型途徑的焦亡是由caspase-4、caspase-5和caspase-11介導。caspase-4/5和caspase-11具有較高的特異性和親和力,可直接與LPS或脂質(zhì)A結(jié)合激活。GSDMD是炎性caspase的直接底物,而活化的caspase-1/4/5/11是四聚體,可以裂解純化的重組GSDMD,生成成熟GSDMD的前焦亡N端片段,觸發(fā)焦亡誘導。caspase-11介導的GSDMD成熟有助于NLRP3依賴性caspase-1激活和IL-1β釋放。激活的caspase-4/5/11可反向激活NLRP3炎性小體,促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌。研究推測過度激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激觸發(fā)的CHOP-caspase-11可能是參與焦亡的重要途徑[9]。caspase-11甚至可以在沒有LPS刺激的情況下激活非典型NLRP3炎性小體。此外,有證據(jù)表明,除GSDMD外,caspase-4/5/11也可作用于通道蛋白Pannexin-1,調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的釋放[10]。

(3)細胞焦亡的其他途徑:除GSDMD外,GSDME是一種新發(fā)現(xiàn)的通過caspase-3的裂解產(chǎn)生焦亡GSDME-N的焦亡介質(zhì)。Hu等[11]研究證明了敲除GSDME基因可抑制細胞焦亡,表明GSDME在此過程中起重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn),抑制GSDME可以減輕小鼠的急性腎損傷和炎癥,表現(xiàn)為GSDME-N表達下調(diào),IL-1β和LDH釋放降低,細胞活力增強[12]。當GSDME高表達時,活性的caspase-3將其切割,釋放N端結(jié)構(gòu)域在細胞膜上打孔,導致細胞腫脹、破裂、死亡,發(fā)生細胞焦亡。當GSDME的表達水平較低時,就會導致細胞死亡的經(jīng)典機制,即凋亡[13]。

二、細胞焦亡與RIRI

1.NLRP3與RIRI:炎性小體是一組細胞內(nèi)蛋白質(zhì)復合物,包括NLR、ASC、caspase-1,有時還有caspase-11。一旦被激活,炎性小體就會作為觸發(fā)caspase-1、細胞因子釋放而發(fā)生細胞焦亡[14]。NLRP3炎性小體在調(diào)節(jié)腎臟炎癥方面的重要作用已在不同的腎臟疾病模型中得到證實。RIRI過程中壞死管狀細胞能夠通過釋放活線粒體激活巨噬細胞中的NLRP3炎性小體。NLRP3缺乏對RIRI后小鼠腎臟炎癥和組織損傷具有保護作用[15]。此外,有研究報道,腎臟相關(guān)的NLRP3損害影響傷口愈合。管狀細胞中NLRP3的缺失可改善再生反應[16]。研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)的腎近端小管細胞中P2X4嘌呤能受體的激活誘導了NLRP3炎性小體的蛋白質(zhì)的mRNA和蛋白表達,NLRP3激活后,NLRP3蛋白復合體低聚并形成炎性小體,隨后caspase-1被激活,促進炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟、蛋白水解裂解和分泌,發(fā)生細胞焦亡,造成腎功能損傷[17]。Zheng等[18]通過采用RIRI建立AKI小鼠模型,評估了缺血性AKI急性期和慢性期腎臟NLRP3的表達。通過RNA測序,發(fā)現(xiàn)嚴重AKI后腎臟NLRP3信號相關(guān)基因上調(diào),CKD活檢發(fā)現(xiàn)NLRP3在腎小管上皮細胞中升高,說明持續(xù)的NLRP3過表達與AKI后的慢性病理改變相關(guān)。這些結(jié)果提示,NLRP3炎性小體可能是治療RIRI損傷的潛在靶點。

2.GSDMD與RIRI:GSDMD由一個242個氨基酸的氨基末端結(jié)構(gòu)域組成,通過一個43個氨基酸的接頭連接到一個199個氨基酸的羧基末端結(jié)構(gòu)域[19]。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄誘導精子形成基因40 (Tisp40)參與了RIRI,研究結(jié)果顯示,Tisp40過表達加重了細胞焦亡,其機制是增加了GSDMD蛋白的表達,敲除Tisp40可顯著降低GSDMD的表達水平,減輕RIRI引起的腎細胞焦亡[3]。此外,GSDMD缺陷小鼠對RIRI誘導的AKI高度敏感,也證明了缺失GSDMD在RIRI中有保護腎小管免受損傷方面作用,其機制是抑制了細胞焦亡[20]。

3.caspase與RIRI:caspase在啟動細胞焦亡中起核心作用,它們通常以不活躍的pro形式存在于細胞質(zhì)中,并被其他caspase的蛋白水解裂解激活。caspase-1在被各種炎性小體激活后引發(fā)細胞焦亡,并導致受影響細胞的裂解[21]。RIRI發(fā)生6h后,caspase-1、caspase-11和IL-1β的水平顯著升高,并在RIRI發(fā)生12h后達到峰值,伴隨腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的升高。研究表明,在RIRI細胞實驗中,低劑量束尼卡霉素預處理可緩解腎組織損傷。其機制是降低caspase-11活性來實現(xiàn),證明了caspase是RIRI發(fā)生細胞焦亡的重要蛋白[9]。

三、細胞焦亡相關(guān)的RIRI治療靶點

1.PRMT5:蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5 (protein arginine methylation transferase 5, PRMT5)是負責精氨酸單甲基化和對稱二甲基化的主要酶,在廣泛的細胞過程中的重要生物學功能[22]。研究表明,抑制PRMT5可以減少RIRI后氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生。而RIRI誘導ROS的產(chǎn)生和炎性反應決定了腎臟損傷的嚴重程度,RIRI誘導的ROS導致炎癥相關(guān)信號因子如NLRP3的釋放,它催化pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為活化的caspase-1,隨后誘導細胞焦亡。抑制PRMT5對RIRI引起的腎臟損傷具有保護作用,防止腎細胞發(fā)生ROS誘導的炎癥和焦亡,并促進腎小管細胞增殖。因此,PRMT5可能是一個很有前途的治療RIRI的靶點[23]。

2.miR-92a-3p:miR-92a-3p是一種非編碼的內(nèi)源性微小RNA,通過靶向信使RNA (mRNA)抑制翻譯[24]。研究表明,miR-92a-3p的抑制可緩解體外氧化應激,降低體內(nèi)外NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平,其機制是 miR-92a-3p的抑制是通過血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)靶向Nrf1來防止TECs氧化應激和細胞焦亡[25]?？蓪iR-92a-3p作為RIRI的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和潛在的生物學標志物或治療靶點。

3.柚皮素:柚皮素是膳食柑橘類水果中存在的一種多酚類成分,因其強大的藥理活性和良好的治療前景。在RIRI過程中,柚皮素可減輕腎組織損傷、Cr、BUN和KIM-1水平,其機制是柚皮素可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,抑制NF-κB信號通路,從而減輕細胞焦亡,從而保護腎臟[26]。

4.青蒿琥酯:青蒿琥酯是由青蒿素提取的半合成化合物,除了抗瘧作用外,還具有抗炎的效果。實驗研究表明,通過青蒿琥酯預處理過的大鼠,通過免疫組化、免疫熒光、蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測NLRP3 炎性小體、caspase-1、GSDMD蛋白及相關(guān)炎性細胞因子的表達,結(jié)果均低于未使用青蒿琥酯預處理的大鼠,表明青蒿琥酯能在RIRI中發(fā)揮抗炎作用。其機制是青蒿琥酯能減少焦亡相關(guān)蛋白的表達,抑制細胞焦亡,從而減輕RIRI[27]。

5.表氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EET): EET是花生四烯酸代謝而來的一類脂肪酸代謝產(chǎn)物,具有舒張血管內(nèi)皮、抗炎及抗細胞凋亡等作用。實驗研究表明,在RIRI小鼠模型中,使用EET干預后,RIRI+EET組腎功能損害及NLRP3炎性小體、caspase-1、IL-1β等蛋白的表達水平均低于RIRI組,表明EET能夠減輕小鼠RIRI,其機制可能是通過抑制NLRP3活化介導的細胞焦亡而產(chǎn)生一定的保護作用[28]。

6.β-羥基丁酸(β-OHB):β-OHB是構(gòu)成酮體的主要成分,低濃度時可以保護缺血組織損傷。在一項關(guān)于β-OHB對RIRI影響的研究中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RIRI小鼠在β-OHB處理后能夠降低了caspase-1和促炎性細胞因子的表達,其機制是β-OHB阻止了細胞焦亡[29]。因此,β-OHB可通過抗焦亡作用減弱RIRI,可能是臨床治療和預防RIRI的一個靶點。

7.水通道蛋白-2(aquaporin protein-2, AQP2):AQP2在細胞焦亡中具有調(diào)節(jié)作用,Fan等[30]探討了AQP2在近端小管細胞中過表達是否可以緩解RIRI相關(guān)的細胞焦亡。建立小鼠RIRI模型,對人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞進行缺氧-給氧處理。與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組腎功能明顯下降,組織損傷嚴重,并伴有更多核溶解和壞死。缺血再灌注組Toll樣受體4、caspase-1、KIM-1、IL-1β、IL-18表達明顯升高。在人腎細胞試驗中也觀察到類似的結(jié)果。過表達AQP2可部分逆轉(zhuǎn)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞缺氧-復氧誘導的細胞損傷、焦亡及分子表達變化。結(jié)果表明,AQP2過表達可能減少近端小管細胞焦亡,因此可能是緩解RIRI中細胞焦亡的新靶點。

8. ETS原癌基因1 (ETS1):Juan等[31]對AKI患者的外周血進行了分析,發(fā)現(xiàn)AKI患者的NLRP3水平和細胞焦亡水平明顯高于正常對照組。此外,LPS處理后腎小管上皮細胞NLRP3水平升高,轉(zhuǎn)錄因子ETS原癌基因1 (ETS1)可與NLRP3上游啟動子轉(zhuǎn)錄位點結(jié)合,使NLRP3在腎小管上皮細胞中轉(zhuǎn)活。敲除ETS1后細胞焦亡水平也降低。敲除ETS1可能通過調(diào)節(jié)NLRP3的轉(zhuǎn)錄來減輕腎小管上皮的細胞焦亡,從而緩解AKI。ETS1有望成為治療AKI的分子靶點。

9.miR-155:Wu等[32]通過建立大鼠RIRI體內(nèi)及體外模型,檢測mRNA表達水平及蛋白表達水平,應用生物信息學分析來預測miR-155靶點,然后通過熒光素酶試驗證實。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RIRI后焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、caspase-11、IL-1β、IL-18水平明顯升高,miR-155在RIRI大鼠腎組織HK2細胞中的表達顯著增加。miR-155的上調(diào)促進HK2細胞的焦亡。研究還證實,miR-155上調(diào)了caspase-1以及促炎細胞因子IL-1β和IL-18的表達,miR-155可能成為RIRI新的治療靶點。

10.丹酚酸B (SalB):SalB是從丹參中提取的化合物,對小鼠RIRI具有保護作用。Pang等[33]研究發(fā)現(xiàn),SalB可以改善腎臟損傷,降低氧化應激和炎性細胞因子水平。RIRI中,顯著上調(diào)的NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β的表達被SalB有效逆轉(zhuǎn),其機制可能是SalB通過激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)/NLRP3信號通路抑制細胞焦亡,從而減輕小鼠RIRI。SalB有望成為臨床治療和防治RIRI的新思路。

11.雙硫侖:雙硫侖是一種眾所周知的解酒藥,它能夠減輕小鼠巨噬細胞的焦亡。研究表明,RIRI可引起小鼠腎功能障礙,并引起腎小管上皮細胞焦亡,雙硫侖可改善RIRI后的腎損害,主要通過抑制非經(jīng)典途徑(caspase-11-GSDMD)來減少細胞焦亡[34]。

綜上所述,深入研究RIRI的發(fā)病機制、探尋新的治療靶點是RIRI研究的重要方向。細胞焦亡與RIRI的發(fā)生關(guān)系密切,通過調(diào)節(jié)細胞焦亡能使腎臟功能得到改善,細胞焦亡調(diào)節(jié)可能成為RIRI治療的新靶點,為臨床工作提供更有效的診療思路。然而細胞焦亡與RIRI具體作用機制及藥物療效的發(fā)揮同細胞焦亡的聯(lián)系還需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。