譚桂湘，鄒大威,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069; 2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的慢性并發(fā)癥之一[1]，也是全世界終末期腎病的主要原因[2]。近10年DN發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢[3]，嚴(yán)重危害患者健康，但DN發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床治療措施十分有限。細(xì)胞焦亡由Cookson和Brennan[4]于2001年提出，是一種促炎程序性細(xì)胞死亡。與其他細(xì)胞死亡相比，細(xì)胞焦亡的主要特點包括胱天蛋白酶(caspase)依賴性、在胞內(nèi)形成炎癥小體和伴隨大量炎癥介質(zhì)釋放等[5]；在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞焦亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂、染色質(zhì)斷裂和核濃縮等。細(xì)胞焦亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6-8]。近年研究表明，細(xì)胞焦亡可通過誘導(dǎo)炎癥加重DN腎臟損傷[9-10]。因此，調(diào)控細(xì)胞焦亡可能成為防治DN的新策略。

微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，主要通過功能基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與多個生理過程[11]。研究顯示，miRNA對細(xì)胞焦亡的調(diào)控在多種疾病的進展中發(fā)揮重要作用[12-14]，且miRNA與細(xì)胞焦亡關(guān)系密切，但關(guān)于miRNA通過相關(guān)信號通路調(diào)控細(xì)胞焦亡的機制仍處于研究階段。另外，諸多文獻已報道m(xù)iRNA在DN中異常表達并可通過氧化應(yīng)激、免疫炎癥、細(xì)胞自噬等機制調(diào)節(jié)DN[15-16]。現(xiàn)通過查閱近年文獻，對miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡的分子機制，以及miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡參與DN進展的作用機制進行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一種由20～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，具有組織特異性、進化保守性、表達階段性和基因簇集性等生物學(xué)特征，動物源性miRNA的基本合成加工過程首先是在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄合成miRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，之后其產(chǎn)物在Drosha酶的RNA水解酶作用下切割形成前體miRNA，再在轉(zhuǎn)運蛋白作用下移至細(xì)胞質(zhì)中，并在Dicer水解酶作用下進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA[17-18]。成熟miRNA主要通過結(jié)合到信使RNA的3′端非翻譯區(qū)，對信使RNA進行剪切和降解,或者通過在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制蛋白質(zhì)翻譯來控制靶基因的表達。miRNA是機體重要的調(diào)節(jié)因子,至少60%的人體蛋白質(zhì)編碼基因表達受到miRNA的調(diào)控，除此之外，miRNA在多個生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用和功能，如細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、癌變、血管生成、胰島素分泌、胚胎組織發(fā)育等。研究顯示，miRNA參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，如糖尿病、胃癌、慢性心力衰竭等，并可作為這些疾病的有效治療靶點[12-14]。

2 miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡的機制

細(xì)胞焦亡受到多種因素直接或間接的調(diào)控，并且存在多條作用途徑，目前研究顯示對細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用集中于對焦亡信號通路中關(guān)鍵靶蛋白的調(diào)節(jié)。根據(jù)其發(fā)生機制，細(xì)胞焦亡可分為caspase-1依賴型的經(jīng)典焦亡通路和caspase-4/5/11依賴型的非經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路。在經(jīng)典途徑中，模式識別受體與含caspase募集域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)共同作用招募caspase-1前體，組成炎癥小體[主要包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)1、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2等][19]，進而激活caspase-1[20]，活化的caspase-1可激活消化道皮膚素D(gasdermin D，GSDMD)[21]，釋放其活性N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上成孔，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，同時將活化caspase-1激活的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18和IL-1β等炎癥介質(zhì)釋放到胞外，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在非經(jīng)典途徑中，人體內(nèi)caspase-4/5前體和小鼠體內(nèi)caspase-11前體在結(jié)合細(xì)菌脂多糖后發(fā)生寡聚而活化[22]，活化的caspase-4/5/11可激活GSDMD、IL-18與IL-1β，在膜上打孔并釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，細(xì)胞發(fā)生焦亡。研究證實miRNA參與調(diào)控細(xì)胞焦亡，其主要作用機制與焦亡通路中相關(guān)分子密切相關(guān)，如NLRP3炎癥小體、ASC、GSDMD等，除此之外，miRNA還可與其他調(diào)節(jié)因子以及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡[23]。

2.1miRNA通過調(diào)節(jié)焦亡通路相關(guān)分子表達直接調(diào)控細(xì)胞焦亡 在細(xì)胞焦亡通路中，ASC、caspase-1、NLRP3、GSDMD等分子表達水平升高既是細(xì)胞焦亡發(fā)生的主要特征，又是細(xì)胞焦亡發(fā)展的必要條件，通過靶向調(diào)節(jié)這些分子的表達，miRNA可直接調(diào)控細(xì)胞焦亡。Gu等[24]證實高糖可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，其中miR-590-3p表達下降，NLRP1表達增加，熒光素酶報告實驗證實miR-590-3p可靶向作用于NLRP1。該模型中轉(zhuǎn)染miR-590-3p抑制劑可增強細(xì)胞焦亡，轉(zhuǎn)染miR-590-3p模擬物可減輕細(xì)胞焦亡。轉(zhuǎn)染干擾小RNA NLRP1后，再轉(zhuǎn)染miR-590-3p模擬物不能繼續(xù)降低細(xì)胞焦亡率，表明miR-590-3p可通過靶向NLRP1調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。Long等[25]發(fā)現(xiàn)在梅毒患者中miR-223-3p表達降低，caspase-1和IL-1β表達上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)膜免疫原rTp17可以誘導(dǎo)T蒼白球感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(T pallidum-infected human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)焦亡，并通過給HUVECs轉(zhuǎn)染miR-223-3p抑制劑和模擬物，證實miR-223-3p可以抑制炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡。通過熒光素酶實驗報告和過表達/敲減NLRP3的實驗，證實miR-223-3p可靶向調(diào)控NLRP3抑制細(xì)胞焦亡。Li等[26]用亞砷酸鹽誘導(dǎo)人肝細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中miR-379-5p表達降低，GSDMD和裂解的caspase-1水平升高，1L-1β釋放增加，肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-379-5p模擬物使miR-379-5p過表達后，細(xì)胞中GSDMD和裂解的caspase-1表達降低，1L-1β釋放減少，細(xì)胞焦亡被抑制，結(jié)合熒光素酶報告基因檢測顯示GSDMD是miR-379-5p的直接靶標(biāo)，證實miR-379-5p通過降低GSDMD表達抑制細(xì)胞焦亡。Han等[27]證實miR-22也可通過抑制GSDMD表達，進而抑制細(xì)胞焦亡。

2.2miRNA與調(diào)節(jié)焦亡的細(xì)胞因子相互作用發(fā)揮間接調(diào)控作用 許多分子如叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box O1,FoxO1)、A20蛋白、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物1(suppressors of cytokine signaling-1，SOCS-1)等雖然沒有直接參與焦亡通路，卻可作為調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞焦亡的調(diào)控，miRNA也能與這些調(diào)節(jié)因子相互作用，間接調(diào)控細(xì)胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)FoxO1可通過降低miR-148A表達，促進NLRP3炎癥小體激活，進而促進細(xì)胞焦亡[28]。Zeng等[29]用1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中FoxO1表達升高，而miR-135b表達降低，過表達miR-135b后，細(xì)胞焦亡相關(guān)分子(如NLRP3炎癥小體、caspase-1和IL-1β)的表達被抑制，過表達FoxO1后可解除miR-135b對細(xì)胞焦亡的抑制作用，結(jié)合熒光素酶報告基因檢測顯示FoxO1是miR-135b的下游靶標(biāo)，表明miR-135b通過作用于FoxO1抑制細(xì)胞焦亡。A20蛋白是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞調(diào)節(jié)因子，可發(fā)揮抗炎作用。Ding等[30]采用高糖干預(yù)巨噬細(xì)胞源性內(nèi)皮細(xì)胞與小鼠足細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡模型，其中miR-21-5p表達升高，過表達miR-21-5p后，A20蛋白表達減少，焦亡相關(guān)分子水平升高，根據(jù)熒光素酶報告基因檢測顯示A20是miR-21-5p的作用靶點，給實驗細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-5p抑制劑后，A20表達升高，焦亡相關(guān)分子水平下降，通過抑制A20表達，則可以消除這些影響，證實miR-21-5p通過靶向抑制足細(xì)胞中A20表達，促進焦亡相關(guān)分子表達，進而促進足細(xì)胞焦亡。此外，Xue等[31]研究證實A20是miR-21的直接靶點，敲除miR-21后，A20表達增加，抑制了NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的caspase-1激活和IL-1β的分泌，ASC寡聚和再分配，以及GSDMD的裂解，進而抑制細(xì)胞焦亡。已證實SOCS-1可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子途徑抑制炎癥反應(yīng)[32]，而miR-155可抑制SOCS-1的表達[33]。Li等[34]發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中miR-155表達顯著增加，而SOCS-1的水平降低，通過轉(zhuǎn)染短發(fā)夾miR-155使miR-155沉默后，SOCS-1表達增加，而細(xì)胞焦亡相關(guān)分子(NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18等)表達均降低，表明miR-155通過抑制SOCS-1表達促進細(xì)胞焦亡。

2.3miRNA與lncRNA共同調(diào)控細(xì)胞焦亡 lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達[35]。已發(fā)現(xiàn)的lncRNA在多種生物過程中起關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、自噬和炎癥等，同時研究證實lncRNA參與調(diào)控細(xì)胞焦亡，而miRNA與lncRNA也能共同影響細(xì)胞焦亡[36]。Song等[37]用一水草酸鈣誘導(dǎo)人近端腎小管上皮(human kidney-2，HK-2)細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中l(wèi)ncRNA LINC00339表達升高，miR-22-3p表達降低。過表達lncRNA LINC00339后可顯著提高HK-2細(xì)胞焦亡相關(guān)分子表達，而轉(zhuǎn)染miR-22-3p模擬物可起到相反的作用。lncRNA LINC00339可通過海綿吸附解除miR-22-3p對NLRP3炎癥小體的抑制，促進HK-2細(xì)胞焦亡。Mao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA Krüppel樣因子3反義RNA 1可通過下調(diào)miR-138-5p表達，降低NLRP3、ASC、裂解的caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18水平，進而抑制心肌細(xì)胞焦亡。Liang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 母系表達基因3可靶向結(jié)合miR-485，提高黑色素瘤缺乏因子2炎癥小體表達，進而促進ASC、caspase-1和GSDMD的表達，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞焦亡。

3 miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡參與DN進展

細(xì)胞焦亡在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[39]。目前認(rèn)為，NLRP3炎癥小體/caspase-1/GSDMD通路是調(diào)節(jié)DN進展的細(xì)胞焦亡相關(guān)通路，如NLRP3炎癥小體的活化啟動了炎癥級聯(lián)反應(yīng)、caspase-1介導(dǎo)了腎臟組織的損傷等。因此，調(diào)控細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路已成為防治DN的新熱點。DN的臨床表現(xiàn)包括腎小球濾過率下降、蛋白尿、腎功能進行性衰退，并最終發(fā)展為腎衰竭，其基本病理特征為腎小管間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、基膜增厚、腎小球肥大、腎小球系膜擴張等[40]。miRNA可通過調(diào)控DN腎臟固有細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，參與DN進展。

3.1腎小管上皮細(xì)胞 腎小管上皮細(xì)胞的損傷在DN早期已經(jīng)出現(xiàn)，并與DN的后期進展密切相關(guān)[41-42]。Xie等[39]用高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中NLRP3炎癥小體、caspase-1、IL-1β、GSDMD-N、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和miR-452-5p的表達升高，而lncRNA 生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)表達降低，在HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染GAS5質(zhì)?；騧iR-452-5p的抑制劑后，lncRNA GAS5表達增加，miR-452-5p表達降低，細(xì)胞焦亡被抑制，結(jié)合熒光素酶報告基因檢測分析顯示lncRNA GAS5可靶向抑制miR-452-5p表達。因此，通過升高lncRNA GAS5的表達或者降低miR-452-5p的表達，可以抑制HK-2細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，進而延緩DN進展。

但是，同一個靶細(xì)胞往往受到多種miRNA的調(diào)控，而不同miRNA的作用往往不同甚至相反，如雖然miR-452-5p可以促進HK-2細(xì)胞焦亡，但是Zhu等[43]證實miR-506-3p可以抑制HK-2細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)；Wang和Zhao[44]研究發(fā)現(xiàn)由于INK4基因座反義非編碼RNA(antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)解除了miR-497對硫氧還蛋白互作蛋白的抑制，NLRP3炎癥小體和caspase-1表達增加，促進HK-2細(xì)胞焦亡；Li等[45]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1)可解除miR-23c對類胚胎致死性異常視覺基因1的抑制，促進NLRP3炎癥小體表達，促使HK-2細(xì)胞焦亡；Liu等[46]發(fā)現(xiàn)，在HK-2細(xì)胞焦亡中，lncRNA MALAT1對于miR-30c的抑制也起著重要作用。此時，若要通過抑制HK-2細(xì)胞焦亡治療DN，就要上調(diào)這些miRNA的表達水平，并抑制某些lncRNA的表達。

3.2足細(xì)胞 足細(xì)胞損傷是DN的最初標(biāo)志之一，在DN發(fā)展中起重要作用[47]。Zuo等[48]用高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3表達提高，lncRNA MALAT1和miR-200c-3p表達也升高，MALAT1基因敲除和miR-200c-3p干擾均可抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞的焦亡，因此通過抑制lncRNA MALAT1和miR-200c-3p的表達，可對防治DN起到一定效果。此外，miR-21-5p可通過靶向抑制足細(xì)胞中A20表達，促進焦亡相關(guān)分子的表達，進而促進足細(xì)胞焦亡，加快DN進展[30]。

3.3腎系膜細(xì)胞 腎系膜細(xì)胞肥大、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)堆積是DN重要的病理標(biāo)志[49]。李嶸等[50]用高糖誘導(dǎo)人腎系膜細(xì)胞焦亡，細(xì)胞中miR-497的表達顯著降低。給腎系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497模擬物使miR-497過表達后，細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和caspase-1表達降低，細(xì)胞焦亡被抑制。通過生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告基因檢測分析顯示，miR-497可直接靶向作用于NLRP1炎癥小體基因，同時根據(jù)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交結(jié)果顯示miR-497可抑制NLRP1炎癥小體表達，通過給細(xì)胞轉(zhuǎn)染NLRP1質(zhì)粒使NLRP1炎癥小體過表達后，可解除miR-497對細(xì)胞焦亡的抑制作用，表明miR-497通過靶向抑制NLRP1炎癥小體表達，減少caspase-1表達和炎癥介質(zhì)分泌，進而抑制腎系膜細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)，延緩DN進展。Zhan等[51]用高糖溶液誘導(dǎo)大鼠腎系膜細(xì)胞焦亡，發(fā)現(xiàn)lncRNA 核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)可通過靶向抑制miR-34c表達，促進NLRP3炎癥小體表達，進而促進大鼠腎系膜細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，加快DN進展，此時通過提高miR-34表達或抑制lncRNA NEAT1表達，可達到治療效果。

4 小 結(jié)

DN發(fā)病率高且預(yù)后差，即便使用目前最佳治療方案也不能完全防止DN患者發(fā)展到終末期腎病，因此需要進一步揭示DN發(fā)病機制。細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡，可作為機體的自我保護反應(yīng)參與有害物質(zhì)的清除，但過度的細(xì)胞焦亡會導(dǎo)致機體紊亂，誘發(fā)多種疾病。目前，高糖、脂代謝異常、氧化應(yīng)激等DN危險因素對于細(xì)胞焦亡影響的研究，以及藥物干預(yù)調(diào)控焦亡抑制DN進展的研究，預(yù)示著通過細(xì)胞焦亡治療DN有望取得突破。miRNA的差異表達與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中miRNA對于細(xì)胞焦亡的調(diào)控起著重要作用。相關(guān)研究表明，miRNA對于細(xì)胞焦亡的調(diào)控主要集中于對焦亡通路中相關(guān)靶分子表達的調(diào)節(jié)，并能與多種調(diào)節(jié)因子以及l(fā)ncRNA共同作用于細(xì)胞焦亡。另外，miRNA可通過調(diào)控DN腎臟固有細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)參與DN進展，但miRNA的作用具有廣泛性和多樣性等特點，不同miRNA對于人體的影響還須更多實驗去驗證。相信隨著對細(xì)胞焦亡機制的進一步研究，以及更多miRNA靶點的發(fā)現(xiàn)，通過miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡來防治DN將會成為臨床治療DN以及新藥研發(fā)的重要思路。