〔摘要〕 目的 研究中藥蕓香（Ruta graveolens L.）中香豆素類化學(xué)成分，并探討其抗炎、抗凝活性。方法 本實(shí)驗(yàn)利用各種色譜分離技術(shù)，結(jié)合核磁共振波譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。CCK-8法篩選出無明顯細(xì)胞毒性的化合物，用于對脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）釋放NO的檢測，進(jìn)行抗炎活性篩選，通過凝血酶原時間的測試進(jìn)行抗凝活性篩選。結(jié)果 從蕓香提取物中共鑒定出10個香豆素類化合物，分別為補(bǔ)骨脂素（1）、花椒毒素（2）、chalepensin（3）、rutamontine（4）、3-（1'，1'， dimethyl allyl）-herniarin（5）、佛手苷內(nèi)酯（6）、異莨菪亭（7）、異嗪皮啶（8）、去甲基軟木花椒素（9）、Chalepin（10）。對10個化合物的抗炎、抗凝進(jìn)行活性評價，結(jié)果顯示，化合物2、4、9在20 μmol/L時對脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)的NO生成有較好的抑制作用，抑制率分別為54.3%±1.7%、51.2%±5.5%、52.3%±1.7%；10個化合物在濃度為1.0 mmol/L條件下，均未表現(xiàn)出抗凝活性。結(jié)論 從蕓香提取物中分離得到10個香豆素類單體化合物，化合物3～5、7～10為首次從蕓香中分離得到。該研究結(jié)果豐富了蕓香的化學(xué)成分和生物活性研究，為蕓香抗炎活性的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 蕓香；結(jié)構(gòu)鑒定；香豆素；藥理活性；抗炎；抗凝

〔中圖分類號〕R284.2" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.007

Chemical components of coumarins in Yunxiang （Ruta graveolens L.）

WANG Yuxin1，2，3， LIU Yanyang2，3，4， HUANG Ling2，3，5， ZHANG Luoyu1，2，3， JIANG Yueping2，3， HUANG Qi2，3*

1. College of Pharmacy， Dali University， Dali， Yunnan 671013， China; 2. Department of Pharmacy， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China; 3. National Clinical Research Center for Geriatric Disorders， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China; 4. Department of Pharmacy， Mianyang 404 Hospital， Mianyang， Sichuan 621053， China; 5. Department of Pharmacy， Luzhou Hospital of Chinese Medicine， Luzhou， Sichuan 646099， China

〔Abstract〕 Objective To study the chemical components of coumarins in Chinese medicine Yunxiang （Ruta graveolens L.） and explore its anti-inflammatory and anticoagulant activities. Methods Various chromatographic separation techniques， combined with nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry were used in this experiment to identify the structures of the isolated monomeric compounds. The CCK-8 method was used to screen out compounds with non-significant cytotoxicity for the measurement of nitric oxide （NO） released by lipopolysaccharide （LPS）-induced mouse macrophages （RAW 264.7）， as well as for anti-inflammatory activity screening. The prothrombin time （PT） was performed to screen for anticoagulant activity. Results Ten coumarin compounds were identified from Yunxiang （Ruta graveolens L.） extract， namely， psoralen （1）， xanthotoxin （2）， chalepensin （3）， rutamontine （4）， 3- （1'，1'， dimethyl allyl）-herniarin （5）， bergapten （6）， isoscopoletin （7）， isofraxidin （8）， demethylsuberosin （9）， and chalepin （10）. Evaluation of the anti-inflammatory and anticoagulant activities of these compounds showed that compounds 2， 4， and 9 exhibited significant inhibitory effects on the production of NO induced by LPS at a concentration of 20 μmol/L， with inhibition rates of 54.3±1.7%， 51.2±5.5%， and 52.3±1.7%， respectively. Besides， none of the ten compounds demonstrated anticoagulant activity at a concentration of 1.0 mmol/L. Conclusion Ten monomeric coumarin compounds were isolated from the extract of Yunxiang （Ruta graveolens L.）， with compounds 3-5 and 7-10 being isolated from Yunxiang （Ruta graveolens L.） for the first time. This study enriches the research on the chemical composition and biological activity of Yunxiang （Ruta graveolens L.）， providing a theoretical basis for the development and utilization of its anti-inflammatory activity.

〔Keywords〕 Yunxiang （Ruta graveolens L.）; structure identification; coumarin; pharmacological activity; anti-inflammatory; anticoagulant

蕓香（Ruta graveolens L.），具有強(qiáng)烈而特殊的氣味，別名臭草，為蕓香科（Rutaceae）蕓香屬（Ruta）的多年生雙子葉草本植物，原產(chǎn)于地中海和亞洲西南部地區(qū)，現(xiàn)分布于世界各地。我國南北方地區(qū)均有種植，主產(chǎn)于東南部和西南部地區(qū)，如福建、廣西等[1]。蕓香全草（地上部分）供藥用，具有清熱解毒、涼血散瘀、利尿等功效，記載于《生草藥性備要》《中國藥用植物圖鑒》《本草綱目拾遺》等。其主要化學(xué)成分有生物堿類、香豆素類、黃酮類、萜類等化合物[2]。本實(shí)驗(yàn)選取蕓香干燥地上部分為研究對象，為從蕓香中獲取更多的單體化合物，本實(shí)驗(yàn)對蕓香經(jīng)水提取之后，又進(jìn)行醇提取。實(shí)驗(yàn)利用各種色譜分離技術(shù)，結(jié)合核磁共振波譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果從蕓香提取物中共鑒定出10個香豆素類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蕓香提取物具有抗炎[3]、抗凝[4]等藥理活性，為探討本實(shí)驗(yàn)所得香豆素類化合物是否也具有抗炎、抗凝活性，從而開展實(shí)驗(yàn)研究，以期為蕓香的藥理活性及其藥用資源的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，對香豆素類抗炎、抗凝活性提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1" 材料

實(shí)驗(yàn)藥材蕓香于2020年6月21日采自中國廣東省肇慶市廣寧縣，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部劉韶教授鑒定為蕓香科植物蕓香（Ruta graveolens L.）的干燥地上部分，藥材標(biāo)本（No.2020001）現(xiàn)保存于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)樓藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞（長沙艾碧維生物科技有限公司，貨號：AW-CCM002）；雙抗（青、鏈霉素）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：SV30010）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2-1）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（長沙艾碧維生物科技有限公司，貨號：AWC0409）；胰酶消化液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0201）；胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司，貨號：10099141）；細(xì)胞凍存液（長沙艾碧維生物科技有限公司，貨號：AWC0229）；凝血酶原試液（德國TECO公司，貨號：10003109）；凝血質(zhì)控血漿（德國TECO公司，貨號：093UK-K272A）；DMEM培養(yǎng)基（德國Sigma公司，貨號：D5796）；色譜純甲醇、乙腈（美國Fisher公司）；分析醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純化水（自制）。

超凈工作臺（型號：YT-CJ-2NB，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：DH-160I，上海三騰儀器有限公司）；倒置生物顯微鏡（型號：DSZ2000X北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；低速離心機(jī)（型號：SL02，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；多功能酶標(biāo)分析儀（型號：MB-530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；血凝儀（型號：MC-4000德國TECO公司）；核磁共振波譜儀（型號：Bruker AV-600，瑞士Bruker公司）；UPLC-6545 Accurate Mass Q-TOF色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200/1260 Series制備型高效液相色譜儀、Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）均購自美國Agilent公司；圓二色譜儀（型號：Jasco J-1815，日本JASCO公司）；自動旋光儀（型號：INESA SGW-3，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；硅膠（200～300目）、GF254硅膠板（青島海洋化工有限公司）；HPD-101大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（瑞士Amersham Blosclences公司）；YMC苯基色譜柱Ph（250 mm×10 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）均購自杭州亞萊博儀器有限公司。

1.2" 提取與分離

稱取蕓香干燥地上部分10 kg，粗稈粉碎，室溫下超聲提取2次（每次加入8 L純化水，提取時間為1 h），過濾（藥渣暫放），合并濾液，減壓濃縮，得粗水提取物浸膏60.5 g。

水提取物通過大孔樹脂（HPD-101）柱色譜分離，以乙醇-水（10%、50%、100%）梯度洗脫，直至溶液顏色無明顯變化，收集流分，分別減壓濃縮干燥后得到3個流分樣品（Fr.A～Fr.C），進(jìn)一步將Fr.C（14.3 g）通過硅膠（200～300目）柱色譜分離，采用洗脫劑依次以100%二氯甲烷、二氯甲烷∶甲醇（100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、1∶1）和100%甲醇梯度洗脫（洗脫劑中均添加0.1%的甲酸水），得到12個樣品組分（Fr.C-1～Fr.C-12）。Fr.C-1在室溫下析出無色針狀晶體，得到化合物1（5.4 mg）。Fr.C-1析晶剩余樣品通過薄層制備板分離（石油醚∶丙酮=5∶1），得到4個組分（Fr.C-1-1～Fr.C-1-4）。Fr.C-1-2通過反向半制備型HPLC（ODS-A柱，乙腈-0.1%甲酸水75∶25，2.0 mL/min）純化得到化合物3（1.7 mg，tR=54.9 min）。Fr.C-3通過Sephadex LH-20柱層析，洗脫條件為石油醚∶二氯甲烷∶甲醇=5∶5∶1，得到10個組分（Fr.C-3-1～Fr.C-3-10）。Fr.C-3-5通過半制備型HPLC（苯基色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水50∶50，2.0 mL/min）純化得到化合物2（14.2 mg，tR=16.6 min）。Fr.C-3-6通過半制備型HPLC（苯基色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水29∶71，

2.0 mL/min）純化得到化合物6（2.3 mg，tR=37.9 min）。Fr.C-6通過Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得到11個組分（Fr.C-6-1～Fr.C-6-11）。Fr.C-6-3在室溫下析出淺黃色晶體，得到化合物4（8.5 mg）。Fr.C-6-5通過半制備型HPLC（苯基色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水35∶65，2.0 mL/min）純化得到化合物5（1.5 mg，tR=28.1 min）。

將超聲提取后的藥渣用8倍量80%乙醇提取1次（提取時間為1 h），過濾（藥渣棄用），合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得到醇提取物浸膏約1 kg。提取物分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，經(jīng)減壓濃縮干燥，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和醇水萃取物3個組分（Fr.D～Fr.F）。乙酸乙酯萃取物（Fr.E約80 g）通過硅膠柱層析色譜柱（200～300目）分離，以二氯甲烷∶甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫，得到9個組分（Fr.E-1～Fr.E-9）。Fr.E-4采用硅膠柱層析（200～300目）分離，以石油醚∶乙酸乙酯（4∶1～1∶2）梯度洗脫，得到7個組分（Fr.E-4-1～Fr.E-4-7）。Fr.E-4-5通過Sephadex LH-20柱層析，二氯甲烷∶甲醇（1∶1）等度洗脫，得到5個組分（Fr.E-4-5-1～Fr.E-4-5-5）。Fr.E-4-5-2通過反向半制備型HPLC（ODS-A柱，乙腈-0.1%甲酸水23∶77，2 mL/min）得到化合物10（13.3 mg，tR=44.0 min）。Fr.E-4-5-4通過半制備型HPLC（pH柱，乙腈-0.1%甲酸水35∶65，2 mL/min）得到化合物9（1.05 mg，tR=32.7 min）。Fr.E-4-6通過Sephadex LH-20柱層析，二氯甲烷：甲醇（1∶1）等度洗脫，得到6個組分（Fr.E-4-6-1～Fr.E-4-6-6）。Fr.E-4-6-2通過反向半制備型HPLC（ODS-A柱，乙腈-0.1%甲酸水13∶87，2.0 mL/min）純化得到化合物7（10.6 mg，tR=33.5 min）、化合物8（9.8 mg，tR=37.8 min）。

1.3" 對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的抑制活性篩選

取處于對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，利用含10%胎牛血清（FBS）加1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基終止消化并計數(shù)，并將細(xì)胞稀釋到5×103個細(xì)胞/孔密度，接種到96孔板中，每孔100 μL，CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。單體化合物配制成10 mmol/L濃度母液，然后用培養(yǎng)基稀釋后，加入96孔培養(yǎng)板至終濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L，培養(yǎng)箱孵育1 h，在96孔板中加入10 μL的CCK-8，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后測定450 nm吸光度，并計算化合物對RAW264.7細(xì)胞生長的存活率。

根據(jù)CCK-8法篩選出無明顯細(xì)胞毒性的較佳濃度為20 μmol/L，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（僅以培養(yǎng)基干預(yù)），LPS組（含1 μg/mL LPS），陽性藥組（地塞米松母液用培養(yǎng)基稀釋至20 μmol/L與1 μg/mL LPS共同處理），化合物組（化合物母液用培養(yǎng)基稀釋至20 μmol/L與1 μg/mL LPS共同處理）。將RAW264.7細(xì)胞以5×103個/孔接種于96孔板孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，按上述分組方法進(jìn)行藥物干預(yù)，每組平行重復(fù)3次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞上清液，將細(xì)胞上清液離心10 min后收集上清液，按照NO測定試劑盒說明書操作，并計算各化合物及陽性藥對NO分泌的抑制率[5]。

1.4" 通過凝血酶原時間（prothrombin time， PT）測試進(jìn)行抗凝血活性篩選

將上述單體化合物母液用pH 7.4 0.02 mol/L Tris-HCl（含5% Tween 80）稀釋至1 mmol/L待測。設(shè)置陽性對照組（藥物∶肝素）和pH 7.4 0.02 mol/L Tris-HCl（含5% Tween 80）的空白對照，每組設(shè)置3個平行組，按照PT試劑盒說明書操作，在37 ℃預(yù)溫比色杯中精確量取5 μL上述溶液，然后加入人質(zhì)控血漿，37 ℃下預(yù)熱2 min，加入PT（37 ℃預(yù)溫）試劑，記錄凝血時間[6-7]。

2 結(jié)果

2.1" 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1" 無色針狀晶體；由HR-ESI-MS：m/z 187.040 4 [M+H]+，推測出其分子式為C11H6O3；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：8.05 （1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.89 （1H，s，H-5），7.87 （1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.53 （1H，s，H-8），6.96 （1H，dd，J=1.2 Hz，2.4 Hz，H-3′），6.38 （1H，d，J=9.6 Hz，H-3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：163.2 （C-2），115.1 （C-3）， 146.5 （C-4），117.0 （C-4a），121.7 （C-5），126.7 （C-6），158.0 （C-7），100.4 （C-8），153.4 （C-8a），148.8 （C-2′），107.6 （C-3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8-9]報道基本一致，故鑒定化合物1為補(bǔ)骨脂素。

化合物2" 白色羽毛狀；由HR-ESI-MS：m/z 217.050 8 [M+H]+，推測出其分子式為C12H8O4；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：8.02 （1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.89 （1H，d，J=2.4 Hz，H-2′），7.55 （1H，s，H-5），6.96 （1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.38 （1H，d，J=9.6 Hz，H-3），4.24 （3H，s，8-OCH3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：162.8 （C-2），115.1（C-3），146.8 （C-4），118.0 （C-4a），114.9 （C-5），128.1 （C-6），149.1 （C-7），133.9 （C-8），144.2 （C-8a），148.6 （C-2′），108.0 （C-3′），61.8 （8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道基本一致，故鑒定化合物2為花椒毒素。

化合物3" 白色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 255.102 3 [M+H]+，推測出其分子式為C16H14O3；1H NMR （400 MHz，CD3OD） δ：7.92 （1H，s，H-4），7.86 （1H，s，H-8），7.85 （1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.47 （1H，s，H-5），6.94 （1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.21 （1H，dd，J=17.6 Hz，10.8 Hz，H-10），5.10 （1H，dd，J=10.4 Hz，1.2 Hz，H-11-trans），5.07 （1H，dd，J=3.2 Hz，1.2 Hz，H-11-cis），1.50 （3H，s，H-12），1.50 （3H，s，H-13）；13C NMR （100 MHz，CD3OD） δ：161.8 （C-2），133.8 （C-3），145.5 （C-4），117.4 （C-4a），121.4 （C-5），126.5 （C-6），157.4 （C-7），99.5 （C-8），152.5 （C-8a），41.5 （C-9），146.8 （C-10），112.6 （C-11），26.7 （C-12），26.7 （C-13），148.5 （C-2′），99.5 （C-3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為chalepensin。

化合物4" 淺黃色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 353.066 6 [M+H]+，推測出其分子式為C19H12O7；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：7.67 （1H，d，J=12.0 Hz，H-4），7.46 （1H，d，J=10.5 Hz，H-5），7.42 （1H，s，H-4′），7.00 （1H，dd，J=8.0 Hz，3.0 Hz，H-6），6.99 （1H，s，H-8′），6.96 （1H，d，J=3.0 Hz，H-8），6.84 （1H，s，H-5′），6.34 （1H，d，J=12.0 Hz，H-3），3.97 （3H，s，7′-OCH3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：159.5 （C-2），114.8 （C-3），143.0 （C-4），114.9 （C-4a），129.2 （C-5），113.9 （C-6），157.3 （C-7），103.2 （C-8），155.4 （C-8a），160.6 （C-2′），137.4 （C-3′），129.3 （C-4′），110.8 （C-4′a），110.8 （C-5′），144.6 （C-6′），149.1 （C-7′），107.2 （C-8′），147.9 （C-8′a），56.5 （7′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為rutamontine。

化合物5" 棕色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 245.113 3 [M+H]+，推測出其分子式為C15H16O3；1H NMR （500 MHz，CD3OD） δ：7.72 （1H，s，H-4），7.43 （1H，d，J=12.6 Hz，H-5），6.77 （1H，dd，J=13.2，3.6 Hz，H-6），6.66 （1H，d，J=3.6 Hz，H-8），6.16 （1H，dd，J=25.8 Hz，H-2′），5.07 （1H，dd，J=13.8 Hz，1.8 Hz，H-3′-trans），5.03 （1H，overlap，H-3′-cis），3.84 （3H，s，7-OCH3），1.45 （3H，s，H-4′），1.45 （3H，s，H-5′）；13C NMR （125 MHz，CD3OD） δ：162.3 （C-2），131.4 （C-3），140.3 （C-4），113.4 （C-4a），130.5 （C-5），114.3 （C-6），162.3 （C-7），102.6 （C-8），156.3 （C-8a），41.3 （C-1′），147.0 （C-2′），112.4 （C-3′），26.7 （C-4′），26.7 （C-5′），56.0 （7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物5為3-（1'，1'， dimethyl allyl）-herniarin。

化合物6" 綠色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 217.047 6 [M+H]+，推測出其分子式為C12H8O4；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：8.10 （1H，dd，J=9.6 Hz，H-4），7.61 （1H，d，J=2.4 Hz，H-2′），7.15 （1H，s，H-8），7.02 （1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.45 （1H，d，J=9.6 Hz，H-3），4.28 （3H，s，5-OCH3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：160.8 （C-2），113.4 （C-3），139.2 （C-4），106.7 （C-4a），149.6 （C-5），113.9 （C-6），157.1 （C-7），94.5 （C-8），152.5 （C-8a），146.0 （C-2′），105.9 （C-3′），61.9 （5-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14-15]報道基本一致，故鑒定化合物6為佛手苷內(nèi)酯（bergapten）。

化合物7" 白色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 193.050 8 [M+H]+，推測出其分子式為C10H8O4；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：7.85 （1H，d，J=14.2 Hz，H-4），7.10 （1H，s，H-5），6.76 （1H，s，H-8），6.20 （1H，d，J=14.2 Hz，H-3），3.91 （3H，s，7-OCH3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：164.1 （C-2），12.6 （C-3），147.1 （C-4），110.0 （C-4a），112.5 （C-5），153.0 （C-6），146.1 （C-7），103.9 （C-8），151.4（C-8a），56.8 （7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16-17]報道基本一致，故鑒定化合物7為異莨菪亭（isoscopoletin）。

化合物8" 白色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z 223.062 0 [M+H]+，推測出其分子式為C11H10O5；1H NMR（600 MHz，CD3OD） δ：7.84 （1H，d，J=14.2 Hz，H-4），6.90 （1H，s，H-5），6.22 （1H，d，J=14.2 Hz，H-3），3.95 （3H，s，6-OCH3），3.95 （3H，s，8-OCH3）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：163.4 （C-2），112.8 （C-3），145.7 （C-4），112.2 （C-4a），105.0 （C-5），147.1 （C-6），144.7 （C-7），136.2 （C-8），146.5 （C-8a），56.9 （6-OCH3），61.5 （8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，故鑒定化合物8為異嗪皮啶（isofraxidin）。

化合物9" 黃色油狀；由HR-ESI-MS：m/z 231.101 4 [M+H]+，推測出其分子式為C14H14O3；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：7.82 （1H，d，J=14.2 Hz，H-4），7.27 （1H，s，H-5），6.70 （1H，s，H-8），6.15 （1H，d，J=9.4 Hz，H-3），5.33 （1H，m，H-2′），3.32 （1H，brd，J=5.3 Hz，H-1′），1.71 （3H，s，H-4′），1.75 （3H，s，H-5′）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：164.1 （C-2），112.9 （C-3），146.3 （C-4），112.0 （C-4a），129.5 （C-5），128.0 （C-6），160.9 （C-7），102.6 （C-8），155.5 （C-8a），28.7 （C-1′），123.0 （C-2′），134.0 （C-3′），25.9 （C-4′），17.8 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19-20]報道基本一致，故鑒定化合物9為脫甲基軟木花椒素（7-demethylsuberosin）。

化合物10" 棕色無定形固體；由HR-ESI-MS：m/z 315.160 1 [M+H]+；[α]25 D+4.6 （c 0.89， MeOH），推測出其分子式為C19H22O4；1H NMR （600 MHz，CD3OD） δ：7.70 （1H，s，H-4），7.36 （1H，s，H-5），6.65 （1H，s，H-8），6.16 （1H，dd，J=18.0 Hz，10.8 Hz，H-2′），5.05 （2H，d，J=10.8 Hz，H-3′），4.71 （1H，m，H-2′′），3.22 （2H，overlap，H-1′′），1.45 （3H，s，H-4′），1.44 （3H，s，H-4′′），1.25 （3H，s，H-5′），1.44 （3H，s，H-5′′）；13C NMR （150 MHz，CD3OD） δ：165.3 （C-2），126.9 （C-3），140.8 （C-4），114.4 （C-4a），124.3 （C-5），124.7 （C-6），164.2 （C-7），97.7 （C-8），155.4 （C-8a），40.3 （C-1′），146.9 （C-2′），121.4 （C-3′），20.6 （C-4′），27.0 （C-5′），30.4 （C-1′′），92.3 （C-2′′），72.3 （C-3′′），25.4 （C-4′′），25.3 （C-5′′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定化合物10為chalepin。

化合物1～10的結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2" 抗炎活性測定

對上述10個化合物進(jìn)行抗炎活性篩選，根據(jù)CCK-8法篩選出無明顯細(xì)胞毒性的濃度為20 μmol/L，結(jié)果表明化合物2、4、9具有較好的抑制RAW264.7細(xì)胞釋放NO活性，抑制率分別為54.3%±1.7%、51.2%±5.5%、52.3%±1.7%（陽性對照地塞米松濃度為20 μmol/L，抑制率為77.8%）。

2.3" 抗凝活性測定

對上述10個化合物進(jìn)行抗凝活性篩選，測試結(jié)果顯示所有化合物在濃度為1.0 mmol/L檢測濃度下所檢測得到的PT范圍為12.8～13.4 s，陽性對照藥物肝素在160 μg/mL檢測濃度下測得PT為21.6 s（已接近2*PT 25.6 s），與陽性對照組相比，結(jié)果表明10個化合物在該實(shí)驗(yàn)條件下均沒有抗凝活性（Pgt;0.05）。

3 討論

本研究報道了采自廣東省肇慶市廣寧縣所產(chǎn)蕓香屬植物蕓香的干燥地上部位進(jìn)行提取分離提取，從蕓香提取物中共分離得到10個香豆素類化合物，除化合物1、2、6外，其余7個化合物均為首次從蕓香分離得到。這10個香豆素類化合物在佛手、花椒、九里香及吳茱萸等蕓香科植物中均有分布。對1～10化合物進(jìn)行抗炎、抗凝活性評價，結(jié)果表明化合物2、4、9對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）的NO產(chǎn)生有較好的抑制作用，但抗凝篩選結(jié)果表明10個單體化合物在濃度為1.0 mmol/L條件下均未表現(xiàn)出抗凝活性。本研究在一定程度上豐富了蕓香化學(xué)成分及生物活性研究，也為后續(xù)關(guān)于蕓香植物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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