宋淑梅++馬睿霄++金楓清++佟長(zhǎng)青++翟興月++李偉

摘 要： 采用硅膠柱色譜及薄層制備色譜等手段從雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）中分離純化出2種化合物。對(duì)所獲得的化合物通過理化常數(shù)測(cè)定、波譜數(shù)據(jù)分析同文獻(xiàn)對(duì)照的方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)，采用CCK-8方法對(duì)雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分分別進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試。結(jié)果表明，從雙齒圍沙蠶中分離得到2種化合物分別為：膽甾-4烯3α，6β醇（1）和 （E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro -1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol（2），且化合物1是首次從沙蠶中分離得到。抑制腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試表明，70%乙醇浸提獲得的雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS、人肝癌細(xì)胞HepG2以及人卵巢癌細(xì)胞SKOV3均具有抑制細(xì)胞增殖作用，且具有劑量和時(shí)間依賴性，可作為潛在的抗腫瘤藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞： 雙齒圍沙蠶；化學(xué)成分；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定；抑制腫瘤細(xì)胞活性

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis），又名沙蟲、海蟲、海蜈蚣等，分類學(xué)上屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門（Annelida）、多毛綱（Polychaeta）、沙蠶科（Nereidae）、圍沙蠶屬（Perinereis） [1]。雙齒圍沙蠶廣泛分布于我國(guó)渤海、黃海、東海、南海沿海灘涂[2]。雙齒圍沙蠶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的粗脂肪、粗蛋白、不飽和脂肪酸，人體必需的八種氨基酸以及多種礦物質(zhì)和維生素，享有海中“冬蟲夏草”的美稱[3-4]。而且沙蠶養(yǎng)殖成本低，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，被廣泛用于魚、蝦、蟹人工育苗和養(yǎng)殖。

沙蠶作為海洋無脊椎動(dòng)物，因其特殊的生活環(huán)境，代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特、生物活性較強(qiáng)的特點(diǎn)。干信等采用氯仿萃取醚脫脂、草酸鹽沉淀、反復(fù)加熱分離即傳統(tǒng)的液體-液體的提取法，以及超臨界CO2技術(shù)從沙蠶中制備了一種雜環(huán)堿（沙蠶毒素）[5]。鄧志會(huì)等采用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜、CM-Sepharose FF陽離子交換色譜和Sephacryl S-100 HR 凝膠過濾色譜，從沙蠶體內(nèi)分離純化出一種分子質(zhì)量為28～32 kDa的具有纖溶活性的新型金屬蛋白酶[6]。鄧志會(huì)等用pH7.4的生理鹽水作為對(duì)照，研究體外沙蠶金屬蛋白酶（NVMP）對(duì)家兔新鮮血液的抗凝血和對(duì)血栓溶解作用[7]。張偉云等從雙齒圍沙蠶體內(nèi)分離出了一種分子量為33 ku和14.4 ku的纖溶酶[8]。白若倫等研究了沙蠶蛋白酶在降低血液黏度方面的藥理作用[9]。張?jiān)讫埖确蛛x純化了的沙蠶蛋白酶（溶栓素），其等電點(diǎn)約為3.0，相對(duì)分子質(zhì)量在30×105左右[10]。沙蠶蛋白酶可以溶解纖維蛋白，有可能用于預(yù)防和治療心、腦梗死，腦動(dòng)脈和肺動(dòng)脈血栓形成等疾病作為降纖和溶栓類藥物[11-13]。李云磊等人對(duì)采集于福建海岸的沙蠶（Nereis virens）用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，得到提取物A2經(jīng)硅膠柱洗脫，獲得的洗脫組分C2具有顯著的體外抑制HeLa細(xì)胞的活性[13]。陳顥等發(fā)現(xiàn)一種從雙齒圍沙蠶和多齒圍沙蠶體內(nèi)提取出的一種溶血栓纖溶酶，該沙蠶激酶可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服藥[14]。潘衛(wèi)東等從雙齒圍沙蠶中發(fā)現(xiàn)一種新的堿性蛋白，該堿性蛋白具有顯著抗菌活性及抗癌作用[15]。汪靖超等人從雙齒圍沙蠶中分離純化出一種蛋白酶，該蛋白酶具有酪蛋白酶活性，有望開發(fā)為一種新型的助消化類藥物[16]。李榮貴等通過運(yùn)用基因工程的方法表達(dá)出了重組沙蠶溶栓性活性蛋白酶（PPA），PPA在體外有纖溶酶原激活活性[17]。但總體來說，對(duì)沙蠶化學(xué)成分的研究報(bào)道還不多。本研究中，對(duì)雙齒圍沙蠶化學(xué)成分進(jìn)行分離純化并對(duì)它的浸膏抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，旨在為雙齒圍沙蠶的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為海洋藥物的研發(fā)提供生物來源。

1 材料和方法

1.1 材料

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）于2013年在遼寧省大連市長(zhǎng)興市場(chǎng)購(gòu)買；硅膠G與GF254購(gòu)自青島海洋化工有限公司；人胃癌細(xì)胞AGS、人肝癌細(xì)胞HepG2、人卵巢癌細(xì)胞SKOV3來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；CCK-8檢測(cè)試劑盒（Dojindo，CK04）來自株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；96孔板（NEST，貨號(hào) 701001）為上海銳賽生物技術(shù)有限公司提供；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 雙齒圍沙蠶浸膏的制備 1 354 g新鮮雙齒圍沙蠶，勻漿粉碎后置于圓底燒瓶中，加入4倍體積70%乙醇熱浸提2 h，濾出提取液，殘?jiān)欣^續(xù)加4倍體積70%乙醇提取，重復(fù)3次。合并提取液，離心取上清液進(jìn)行減壓濃縮，將濃縮液凍干后得總浸膏。

將上述得到的總浸膏依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取3次。將萃取液減壓濃縮，自然風(fēng)干，得到石油醚層浸膏（7.06 g），乙酸乙酯層浸膏（3.77 g），正丁醇層浸膏（11.44 g）。

1.2.2 雙齒圍沙蠶化學(xué)成分的分離純化 石油醚層浸膏5.5 g，溶解于適量的石油醚中，然后將其滴加到8.2 g硅膠（300～400目）中，充分?jǐn)嚢枋箻悠放c硅膠充分吸附，然后靜置將石油醚揮干備用。

稱取硅膠（300～400目）44 g，濕法裝柱后用石油醚進(jìn)行洗脫平衡，然后將上述揮發(fā)完全的拌樣硅膠均勻加入，用石油醚-丙酮體系（100∶0～0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)比例洗脫5個(gè)柱體積，收集并濃縮洗脫液。然后通過薄層層析法進(jìn)行跟蹤分析，合并類似組分，得到a、b、c、d、e、f、g、h 8個(gè)組分。對(duì)組分b進(jìn)行制備薄層色譜層析，重結(jié)晶得到化合物1。

乙酸乙酯層浸膏3 g溶解于適量乙酸乙酯中，然后將其滴加到4.5 g硅膠（300～400目）中，充分?jǐn)嚢枋箻悠放c硅膠充分吸附，然后靜置將石油醚揮干備用。

稱取硅膠（300～400目）30 g，濕法裝柱后用二氯甲烷進(jìn)行洗脫平衡，然后將上述揮發(fā)完全的拌樣硅膠均勻加入，用二氯甲烷-甲醇體系（100∶0～0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)比例洗脫5個(gè)柱體積，收集并濃縮洗脫液。然后通過薄層層析法進(jìn)行跟蹤分析，合并類似組分，得到A、B、C 3個(gè)組分。對(duì)組分A進(jìn)行制備薄層色譜層析，得到A1、A2、A3 3個(gè)亞組分，亞組分A2重結(jié)晶得到化合物2。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 核磁共振光譜（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振儀（500/125 MHz）上進(jìn)行，以四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 體外抗腫瘤活性測(cè)定 稱取雙齒圍沙蠶總浸膏 16 mg ，加8 mL超純水溶解配制成濃度為2 mg/mL的母液備用。稱取雙齒圍沙蠶總浸膏24 mg，用4 mL乙酸乙酯溶解配制成濃度為6 mg/mL的母液備用。

將細(xì)胞懸液（SKOV3/AGS/HepG2：5×103個(gè)細(xì)胞/孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，加入上述樣品溶液，使最終濃度分別為2、20、200 μg/mL。于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6、12及36 h后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，測(cè)定其在450 nm處的吸光值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X ±S表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

用70%乙醇對(duì)雙齒圍沙蠶進(jìn)行熱浸提后，得到雙齒圍沙蠶浸膏。然后對(duì)得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取，得到3部分萃取物。利用薄層層析、硅膠柱層析、沉淀薄層色譜（pTLC）及重結(jié)晶等多種手段，分別對(duì)石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分及正丁醇萃取部分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。從石油醚萃取部分分離得到1種化合物為化合物1，從乙酸乙酯萃取部分分離得到1種化合物為化合物2。從正丁醇層獲得的化合物有待于進(jìn)一步鑒定。

化合物1：白色針狀晶體，mp 246～250 ℃，Liebermann-Burchard 反應(yīng)呈陽性，表明化合物1可能為甾體類化合物，分子式為C27H46O2。 1H NMR δ：5.5（1H，bs），0.73（3H，s），1.23（3H，s），0.92（d，J=6Hz），0.85（H，d，J=6.6Hz），087（3H，d，J=6.6Hz）；13C NMR δ：38.53、2772、66.5、127.63、147.6、73.12、27.26、35.01、53.84、36.9、21.36、29.56、42.4、55.55、22.94、39.16、55.75、11.9、21.13、35.36、17.42、36.24、23.24、38.68、27.1、21.13、21.36。以上波普數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)[18]對(duì)照，確定化合物1為膽甾-4烯3α，6β醇（Cholest-4-ene-3α，6β-diol），此化合物為首次從沙蠶中分離得到（圖1）。

圖1 化合物1化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物2：無色針狀結(jié)晶，mp 137-138 ℃，Liebermann-Burchard 反應(yīng)呈陽性，表明化合物2可能為甾體類化合物，分子式為C29H48O。1H NMR δ：0.69（3H，s），0.89 （3H，1.09） ，2.32 （25H，m），2.02（1H，s） 3.53（1H，m）， 5.18（2H，m），5.36（1H，m） .13C NMR δ：37.57、3178、71.79、42.38、140.86、121.69、31.72、3328、52.27、36.58、21.17、28.30、42.38、56.94、24.37、38.89、56.84、11.94、19.46、35.85、18.81、36.29、31.99、136.10、131.92、33.28、22.63、2286、21.17.以上波普數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)[19]對(duì)照，最終確定化合物2為：（E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol（圖2）。

圖2 化合物2化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

沙蠶總浸膏對(duì)AGS細(xì)胞（圖3 A）、HepG2細(xì)胞（圖3 B）以及SKOV3（圖3 C）3株腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)活力抑制活性測(cè)定結(jié)果。由圖可以看出：沙蠶總浸膏濃度為200 μg/mL時(shí)，其對(duì)AGS細(xì)胞的抑制活性在其與細(xì)胞作用2 h后就顯示出抑制作用，并且隨著作用時(shí)間的增加，對(duì)細(xì)胞的抑制作用也隨之加強(qiáng)。沙蠶總浸膏與HepG2細(xì)胞作用時(shí)，樣品濃度為200 μg/mL時(shí)，作用時(shí)間為6 h時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制作用，作用36 h后抑制作用十分顯著，抑制率為34.04%。沙蠶總浸膏與SKOV3相作用時(shí)，樣品濃度為200 μg/mL時(shí)，從作用2 h開始就表現(xiàn)出了較為顯著的抑制活性，且隨著作用時(shí)間的增加，抑制能力加強(qiáng)，在作用時(shí)間為12和36 h時(shí)的抑制率分別為43.3%和789%。沙蠶總浸膏在濃度分別為2 μg/mL和20 μg/mL時(shí)針對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的抑制活性均不顯著。

A-AGS，B-HepG2，C-SKOV3

圖3 沙蠶總浸膏對(duì)三種癌細(xì)胞的抑制活性

圖4為乙酸乙酯層浸膏對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的抑制活性。從圖中可以看出乙酸乙酯萃取部分與AGS細(xì)胞作用時(shí)，乙酸乙酯萃取部分在濃度為200 μg/mL時(shí)作用時(shí)間在2 h就開始表現(xiàn)出明顯的抑制活性，并隨著作用時(shí)間的增加而活性增加，最后在200 μg/mL濃度作用36 h后抑制率達(dá)到40.24%（圖4 A）。乙酸乙酯萃取部分與HepG2細(xì)胞作用時(shí)，從低濃度的2 μg/mL到200 μg/mL均表現(xiàn)出了抑制活性，而且抑制活性從作用時(shí)間2 h就開始表現(xiàn)出來，直到作用時(shí)間達(dá)到36 h，抑制活性隨時(shí)間增加而增強(qiáng)，且在200 μg/mL的抑制活性最強(qiáng)（圖4 B）。乙酸乙酯萃取部分與SKOV3細(xì)胞作用時(shí)，低濃度的樣品沒有表現(xiàn)出明顯抑制活性，在200 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出顯著的抑制活性，在作用36 h后抑制率達(dá)到47.2%（圖4 C）。

A-AGS，B-HepG2，C-SKOV3

圖4 乙酸乙酯萃取部分對(duì)三種癌細(xì)胞的抑制活性

3 討論

用70%乙醇對(duì)雙齒圍沙蠶進(jìn)行熱浸提后，得到雙齒圍沙蠶浸膏。然后對(duì)得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取并進(jìn)一步分離純化，獲得2個(gè)化合物。化合物1為膽甾-4烯3α，6β醇，此化合物為首次從雙齒圍沙蠶中分離得到?；衔?最初發(fā)現(xiàn)于紅藻Acantophora spicifera中[18]?；衔?為（E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，化合物2首先發(fā)現(xiàn)于柳珊瑚中[19]。

抑制腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試表明，70%乙醇浸提獲得的雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS、人肝癌細(xì)胞HepG2以及人卵巢癌細(xì)胞SKOV3均具有一定的抑制細(xì)胞增殖作用，且具有劑量和時(shí)間依賴性，這提示進(jìn)一步對(duì)雙齒圍沙蠶浸膏進(jìn)行研究，可能獲得潛在的具有腫瘤細(xì)胞的化學(xué)成分。

在雙齒圍沙蠶中不斷發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)成分，豐富了雙齒圍沙蠶化學(xué)成分的數(shù)據(jù)，為利用雙齒圍沙蠶做為海洋藥物的來源提供了更多的可能性。

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Constituents in Perinereis aibuhitensis and inhibitory activity of all extracts from P.aibuhitensis against tumour cells

SONG Shu mei1，MA Rui xiao1，JIN Feng qing1，TONG Chang qing1，ZHAI Xing yue2，LI Wei1

（1.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China； 2.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China）

Abstract ：Two compounds were isolated from Perinereis aibuhitensis by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on tumour cells of all extracts from P.aibuhitensis were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that two compounds were obtained and identified as cholest-4-ene-3α，6β-diol and （E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-3-ol.All extracts from P.aibuhitensis using 75% EtOH and ethyl acetate layer exhibited the potent inhibitory activities against HepG2，AGS and SKOV3 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.

Key words ：Perinereis aibuhitensis；constituent；structural identification；tumour cell

（收稿日期：2015-07-29）