趙佳偉 鄭 佳,3 李 茂 張偉建 晏俊玲

苦蕎屬蓼料雙子葉植物,富含氨基酸、蛋白質(zhì)和多酚等營(yíng)養(yǎng)元素[1-2],其中酚類化合物是其重要的保健成分。研究顯示,苦蕎中酚類化合物主要以蘆丁、槲皮素為主,也含有原兒茶酸、綠原酸、山奈酚等物質(zhì)[3],這些成分具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、抗炎、抑菌、抗氧化、降血糖等功效[4-5]。

作為一種藥食同源植物,苦蕎具有較高的營(yíng)養(yǎng)食用價(jià)值和藥用價(jià)值,可入藥或作為食品,以苦蕎為原料釀造的苦蕎酒是許多少數(shù)民族的傳統(tǒng)飲品[6],苦蕎酒糟是其主要的釀造副產(chǎn)物。研究[7]表明,在蒸餾生產(chǎn)過(guò)程中,發(fā)酵物料中一些不揮發(fā)性組分如蛋白質(zhì)、多糖和多酚等天然活性物質(zhì),基本殘留在酒糟中。目前對(duì)苦蕎酒酒糟的研究主要集中在飼料的開(kāi)發(fā)、特定物質(zhì)的提取等方面[8-9],而有關(guān)酒糟中天然活性物質(zhì)的組成研究較少。試驗(yàn)擬利用HPLC和LC-MS相結(jié)合,對(duì)苦蕎酒酒糟提取物中酚類化合物的組成進(jìn)行分析,并對(duì)苦蕎酒酒糟的抗氧化活性進(jìn)行研究,以期為苦蕎酒酒糟的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎酒酒糟:實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵型苦蕎酒過(guò)濾后所得;

蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、沒(méi)食子酸、原兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品:北京偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院;

異槲皮素:成都麥德生科技有限公司;

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、ABTS溶液:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

氫氧化鈉、亞硝酸鈉等:分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;

乙腈、甲醇、乙醇:LC-MS級(jí),美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀:1290系列,美國(guó)Agilent公司;

質(zhì)譜檢測(cè)器:6520B系列,美國(guó)Agilent公司;

紫外分光光度計(jì):EVOLutIon 300型,美國(guó)Thermo Scientific公司;

高效液相色譜儀:1260型,美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎酒酒糟活性成分提取 將蒸餾過(guò)后的苦蕎酒酒糟于55 ℃烘干,研磨,過(guò)60目篩。根據(jù)文獻(xiàn)[10]對(duì)苦蕎酒酒糟中酚類化合物進(jìn)行萃取,過(guò)濾,收集濾液備用。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

(1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:根據(jù)文獻(xiàn)[10],以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.073 5x-0.000 3,R2=0.999 92。

(2) 酒糟中總黃酮含量測(cè)定:取0.5 mL樣品提取液,測(cè)定508 nm處吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮濃度。以乙醇作為空白,按式(1)計(jì)算總黃酮含量。

X=(m×d)/W,

(1)

式中:

X——目標(biāo)物總含量,mg/g;

m——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的目標(biāo)物質(zhì)量,mg;

W——樣品質(zhì)量,g;

d——稀釋倍數(shù)。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

(1) 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:稱取0.02 g沒(méi)食子酸,用5 mL蒸餾水溶解,定容,得到2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。采用福林酚法[11]測(cè)樣品中總酚含量,以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.016 82x+0.002 7,R2=0.993 1。

(2) 酒糟中總酚含量測(cè)定:取1 mL樣品提取液,測(cè)定765 nm處吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總酚濃度。以20%的Na2CO3溶液作為空白,按式(1)計(jì)算總酚含量。

1.3.4 酒糟中酚類化合物的HPLC分析

(1) 黃酮類化合物:根據(jù)文獻(xiàn)[12]并修改。流動(dòng)相為乙腈(C相)和0.5%冰乙酸水溶液(B相);進(jìn)樣量10 μL;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;梯度洗脫程序:0～15 min,0～25% C;15～18 min,25%～27% C;18～35 min,27%～29% C;35～40 min,29%～30% C;40～55 min,30%～50% C。

(2) 酚酸類化合物:根據(jù)文獻(xiàn)[13]并修改。流動(dòng)相為甲醇(C相)和0.1 %甲酸水溶液(B相);10 μL進(jìn)樣量;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;梯度洗脫程序:0～8 min,5%～8% C;8～17 min,8%～10% C;17～20 min,10%～12% C;20～25 min,12%～15% C;25～33 min,15%～22% C;33～50 min,22%～50% C。

1.3.5 苦蕎酒糟中酚類化合物的LC-MS分析

(1) 樣品前處理:取10 mL酒糟提取液于45 ℃旋蒸除乙醇,用水稀釋至10 mL,將液體用HLB小柱過(guò)濾,0.1 g/L甲酸水淋洗,90%甲醇水溶液洗脫,氮?dú)獯蹈纱郎y(cè)。

(2) 色譜條件:根據(jù)文獻(xiàn)[14]。

(3) 質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源(DESI),負(fù)離子模式掃描,離子源溫度325 ℃,干燥氣流量10 L/min,霧化器壓力0.3 MPa,碰撞電壓110 V。

1.3.6 苦蕎酒酒糟提取物的體外抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除能力:根據(jù)文獻(xiàn)[15],按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

R=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,

(2)

式中:

R——自由基清除率,%;

Ai——517 nm處的吸光值;

Aj——乙醇代替樣品在517 nm處的吸光值;

A0——蒸餾水代替酒糟提取液在517nm處的吸光值。

(2) 羥自由基清除能力:根據(jù)文獻(xiàn)[16],按式(2)計(jì)算羥自由基清除率。

(3) ABTS+自由基清除能力:根據(jù)文獻(xiàn)[15],按式(2)計(jì)算ABTS+自由基清除率。

(4) FRAP法測(cè)定酒糟提取物抗氧化能力:根據(jù)文獻(xiàn)[17]并修改。取20 μL不同質(zhì)量濃度酒糟提取液(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL),加入FRAP工作液180 μL混勻,加入0.5,1.0,2.0,4.0,5.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.028 1x+1.460 5,R2=0.995 7?？寡趸钚砸詠嗚F當(dāng)量表示(FRAP,mmol/L)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018軟件制圖,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較和方差分析,顯著性水平為0.05,字母不同表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)含量

試驗(yàn)測(cè)得苦蕎酒酒糟中總黃酮含量為(20.714±0.320) mg/g,總酚含量為(5.708±0.250) mg/g。經(jīng)發(fā)酵后的苦蕎酒酒糟中總黃酮和總酚含量均高于苦蕎原料(總黃酮12.970 mg/g,總酚4.910 mg/g),可能是由于在發(fā)酵前對(duì)苦蕎原料進(jìn)行了浸泡處理,而浸泡會(huì)激活苦蕎中的多種酶類,在酶作用下將結(jié)合態(tài)的黃酮類和酚類物質(zhì)水解成游離態(tài)[18]。此外,發(fā)酵過(guò)程中的微生物可以將植物細(xì)胞壁中的纖維素、果膠等大分子物質(zhì)分解,改變細(xì)胞壁通透性,使其更好溶出[19]。

2.2 酚類化合物HPLC分析

2.2.1 黃酮類化合物 由圖1可知,酒糟中黃酮類化合物包括蘆丁、異槲皮素、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚。相關(guān)研究表明,苦蕎中黃酮類化合物含量豐富,其中以蘆丁、槲皮素為主[20];四川苦蕎中也含有山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷等物質(zhì)[21-22],與試驗(yàn)結(jié)果相似。此外,苦蕎酒糟中含有異槲皮素,說(shuō)明發(fā)酵后的苦蕎酒糟中也含有豐富的黃酮類化合物。

1. 蘆丁 2. 異槲皮素 3. 山奈酚-3-o-蕓香糖苷 4. 槲皮素 5. 山奈酚

2.2.2 酚酸類化合物 由圖2可知,苦蕎酒糟中含有的酚酸類化合物主要為沒(méi)食子酸和原兒茶素。楊紅葉等[23]研究顯示,苦蕎中含有沒(méi)食子酸、原兒茶素、香草酸、咖啡酸、阿魏酸。試驗(yàn)酚酸類化合物只檢出了沒(méi)食子酸和原兒茶素,除了因原材料不同外,也可能是由于原料中的酚酸類化合物隨發(fā)酵進(jìn)入了發(fā)酵液,而留在酒糟中的含量及種類相應(yīng)減少導(dǎo)致的。

1. 沒(méi)食子酸 2. 原兒茶素

2.3 酚類化合物的LC-MS分析

由圖3可知,苦蕎酒糟提取物中含有7種酚類化合物,LC-MS檢測(cè)結(jié)果與HPLC的相似,說(shuō)明苦蕎酒酒糟中富含酚類物質(zhì)。由表1可知,黃酮類化合物中蘆丁含量最高為(9.350±0.050) mg/g、其次為槲皮素、異槲皮素、山奈酚-3-o-蕓香糖苷和山奈酚;酚酸類化合物中,沒(méi)食子酸含量為(0.254±0.030) mg/g、原兒茶素含量為(0.352±0.040) mg/g。綜上,發(fā)酵后的苦蕎酒酒糟中含有7種酚類物質(zhì),其中蘆丁含量最高。陳月等[24]研究表明,蘆丁為苦蕎粉中重要的酚類物質(zhì),含量一般可達(dá)8.99 mg/g。與孫坤坤[3]的研究結(jié)果相比,苦蕎酒酒糟中山奈酚-3-o-蕓香糖苷和山奈酚的含量高于其結(jié)果,槲皮素含量則相似;此外,與楊紅葉等[23]相比,苦蕎酒酒糟中酚酸類化合物(原兒茶素和沒(méi)食子酸)含量均高于其試驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明經(jīng)過(guò)發(fā)酵蒸餾后,苦蕎中的酚類物質(zhì)基本殘留在酒糟中,并未進(jìn)入到酒體中,因此可以對(duì)酒糟進(jìn)一步加工開(kāi)發(fā)。

表1 苦蕎酒酒糟中目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間、質(zhì)荷比、線性方程

圖3 苦蕎酒糟中酚類化合物總離子流圖

2.4 酒糟提取物的體外抗氧化活性

2.4.1 羥自由基清除能力 由圖4(a)可知,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL時(shí),羥自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而上升。維生素C的清除能力要稍強(qiáng)于苦蕎酒酒糟。當(dāng)酒糟提取物質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),羥自由基清除率為(73.29±0.09)%。與茶酒酒糟相比(其半抑制濃度為2.74 mg/mL),苦蕎酒酒糟有著更強(qiáng)的羥自由基清除能力[25]。半抑制濃度(IC50)越小,抗氧化能力越強(qiáng),且苦蕎酒酒糟和維生素C的IC50相差不大,分別為0.032,0.018 mg/mL,說(shuō)明苦蕎酒酒糟有著較好的羥自由基清除效果。

圖4 苦蕎酒酒糟提取物抗氧化活性

2.4.2 ABTS+自由基清除能力 由圖4(b)可知,隨著樣品質(zhì)量濃度不斷增加,苦蕎酒酒糟對(duì)ABTS+的清除率呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí),清除率可以達(dá)到(96.00±0.98)%。在低濃度下(<0.3 mg/mL)苦蕎酒酒糟的清除能力低于維生素C,但在質(zhì)量濃度>0.4 mg/mL時(shí),清除能力與維生素C的基本一致。酒糟和維生素C的IC50分別為0.052,0.02 mg/mL,與白酒酒糟(IC50為0.44 mg/mL)的結(jié)果相似[26]。說(shuō)明苦蕎酒酒糟在一定質(zhì)量濃度條件下對(duì)ABTS+自由基有著較強(qiáng)的清除效果。

2.4.3 DPPH自由基清除能力 由圖4(c)可知,DPPH自由基清除率與濃度呈正相關(guān),隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基清除率也不斷提高。與維生素C相比,低濃度的苦蕎酒酒糟對(duì)DPPH自由基的清除力較弱,但隨著質(zhì)量濃度不斷增加,差距不斷縮小,在0.5 mg/mL時(shí)清除力達(dá)到(82.55±0.68)%?？嗍w酒酒糟和維生素C的IC50值分別為0.24,0.03 mg/mL,說(shuō)明苦蕎酒酒糟對(duì)DPPH自由基有著一定的清除能力。

2.4.4 FRAP還原鐵能力 由圖4(d)可知,隨著樣品質(zhì)量濃度的上升,苦蕎酒酒糟的FRAP值顯著升高。當(dāng)質(zhì)量濃度<0.4 mg/mL時(shí),苦蕎酒酒糟的還原力低于維生素C的;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),FRAP值為(2.49±0.09) mmol/L,與維生素C的還原力基本一致,說(shuō)明樣品質(zhì)量濃度較高時(shí),苦蕎酒酒糟具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,苦蕎酒酒糟中總黃酮含量為(20.714±0.320) mg/g,總酚酸含量為(5.708±0.250) mg/g。利用HPLC和LC-MS相結(jié)合,對(duì)苦蕎酒糟中酚類化合物的組成進(jìn)行了分析,共檢測(cè)出7種物質(zhì)(5種黃酮類化合物和2種酚酸類化合物),其中蘆丁含量最高達(dá)到(9.350±0.050) mg/g,其次為槲皮素、異槲皮素、山奈酚-3-o-蕓香糖苷和山奈酚,經(jīng)發(fā)酵蒸餾后,苦蕎中的酚類物質(zhì)基本殘留在酒糟中?？寡趸u(píng)價(jià)結(jié)果顯示,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,其抗氧化能力逐漸提高,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基、ABTS+自由基、DPPH自由基的清除率分別為(73.29±0.09)%,(96.21±0.25)%,(82.55±0.68)%,FRAP值為(2.49±0.09) mmol/L。在低質(zhì)量濃度下,苦蕎酒酒糟對(duì)羥自由基和ABTS+自由基表現(xiàn)出較好的清除效果,說(shuō)明苦蕎酒酒糟具有較好的體外抗氧化活性。但是,研究還未對(duì)苦蕎酒酒糟提取物中全部的酚類化合物進(jìn)行鑒定,后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離鑒定。