邵林子,程玉嬌,黃林華,談安群,王 華

西南大學(xué)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 國家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶 400712

枳實(shí)作為我國傳統(tǒng)中藥材應(yīng)用廣泛且歷史悠久,在許多經(jīng)典名方中常與其他藥材配伍使用,有破氣消積、化痰散痞的功效[1],現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)枳實(shí)的標(biāo)志性生物活性成分主要為所屬生物堿類的辛弗林,其存在3種異構(gòu)體,即p-辛弗林(對位)、m-辛弗林(間位)和o-辛弗林(鄰位),其結(jié)構(gòu)式如圖1所示,但天然存在于植物中且含量最高的主要是p-辛弗林[2]。美國等西方國家通常將辛弗林應(yīng)用于減肥產(chǎn)品,在南非,它被用于治療失眠、焦慮和癲癇等疾病。辛弗林還具有調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝[3]、抗抑郁[4]、改善胃腸道功能[5]、抗癌[6]等眾多生理活性,除此之外,辛弗林對帕金森癥[7]、脫發(fā)[8]的治療也表現(xiàn)出巨大潛力。

圖1 辛弗林的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of synephrine

目前,傳統(tǒng)有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、氯仿和乙酸乙酯被廣泛用于從植物中提取天然活性化合物,然而,這通常存在能耗高、污染環(huán)境和溶劑殘留等固有缺陷,因此尋找新型高效的綠色溶劑應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取顯得十分必要。隨著綠色提取概念的提出,深共晶溶劑(deep eutectic solvents,DES)在2003年被首次提出并將其定義為以氫鍵供體(hydrogen-bond acceptor,HBA)和氫鍵受體(hydrogen-bond donor,HBD)共同組成的混合物,二者主要通過氫鍵和范德華力結(jié)合在一起[9]。DES因其價(jià)格低廉、配比靈活、低毒性、可回收和環(huán)境友好等特點(diǎn)而被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域,如催化化學(xué)、電化學(xué)、材料化學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)和有機(jī)合成[10,11]。另外DES作為新型環(huán)保溶劑用于天然生物活性物質(zhì)的提取已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道,對黃酮[12,13]、多糖[14]、酚酸[12]、生物堿[15]、皂苷和蒽醌[12,13]等天然活性化合物均具有優(yōu)良的提取效率。DES作為提取溶劑應(yīng)用于提取枳實(shí)或枳殼中活性物質(zhì)的研究雖已有少量文獻(xiàn)報(bào)道[16,17],但目前用于提取枳實(shí)、枳殼活性物質(zhì)的DES種類較少,提取的目標(biāo)物質(zhì)也局限于黃酮類,還未見超聲輔助DES提取枳實(shí)辛弗林的研究報(bào)道。

本研究以重慶潼南枳實(shí)為原料,首次提出以DES代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑超聲輔助提取枳實(shí)中辛弗林的方法。制備DES時(shí)HBA選擇常用的氯化膽堿和甜菜堿,HBD包含糖基類、醇基類、酰胺類和有機(jī)酸類,以篩選出提取效果最佳的DES。系統(tǒng)優(yōu)化了液料比、提取時(shí)間和超聲功率等工藝參數(shù),并對枳實(shí)辛弗林提取過程進(jìn)行初步的動(dòng)力學(xué)分析,建立超聲輔助深共晶提取枳實(shí)辛弗林的動(dòng)力學(xué)模型,為DES的應(yīng)用拓展和枳實(shí)辛弗林的提取工藝優(yōu)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

枳實(shí)于2022年6月采自重慶潼南瑋益大健康產(chǎn)業(yè)有限公司,由西南大學(xué)柑桔研究所王華研究員鑒定為蕓香科柑橘屬植物酸橙(CitrusaurantiumL.)干燥幼果。

辛弗林(分析對照品,HPLC ≥98%)(色譜級,Solarbio公司,批號719B021);甲醇、磷酸、十二烷基磺酸鈉(色譜級,上海麥克林生化科技有限公司,批號:C13236982、C15587487、C12475132);一水甜菜堿、果糖、木糖醇、山梨糖醇、1,4-丁二醇、乙酰胺(分析純,上海麥克林生化科技有限公司,批號:C15119883、C15587450、C14528338、C14526881、C10375005、C14334228);氯化膽堿(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司、批號:F2205152);葡萄糖、蔗糖、乙二醇、丙三醇、尿素、檸檬酸、乳酸、草酸(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號:2018110101、2019060101、2019061001、2016041101、2019060101、2017093001、2022120601、20171101 01);尼羅紅、蘋果酸(分析純,上海源葉生物科技有限公司,批號:M18HS175211、C02N9M74070);醋酸、甲醇、乙醇(分析純,重慶川東化工有限公司,批號:20190701、20211201、20211001)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DP-800超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司);Ultimate3000高效液相色譜儀(美國戴安公司);S230 Seven Compact電導(dǎo)率儀(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);PHSJ-3F雷磁pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);NDJ-79型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)(上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司);cary50紫外分光光度計(jì)(美國Agilent公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DES制備

采用直接加熱法合成DES,按照表1設(shè)定的摩爾比準(zhǔn)確稱取HBA和HBD于燒杯中,將其保持在80～85 ℃條件下攪拌2 h左右,直至形成透明液體,必要時(shí)添加一定量的水以降低粘度,冷卻至室溫后備用。

表1 深共晶溶劑的制備

1.2.2 DES理化性質(zhì)測定 對制備好的DES測定相關(guān)理化指標(biāo):極性、粘度、pH、電導(dǎo)率、密度。

參照Fu等[20]的方法,使用尼羅紅染料作為溶劑顯色探針,添加到DES中,在400～800 nm波長下光譜掃描,記錄最大吸收波長,公式(1)用于計(jì)算尼羅紅極性參數(shù)ENR。

(1)

式中:ENR為尼羅紅極性參數(shù),kcal/mol;h為普朗克常數(shù);c為真空光速,m/s;NA為阿伏加德羅常數(shù);λmax為最大紫外吸收波長。

使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)在室溫下測定DES的粘度;使用pH計(jì)在室溫下測量DES的pH;使用電導(dǎo)率儀在室溫下測量DES的電導(dǎo)率;采用等體積法測定DES的密度。

1.2.3 供試液的制備

精密稱取0.1 g枳實(shí)粉末,按照一定的料液比(1∶10～1∶300)加入DES,搖勻使其充分混合后,在80～480 W的功率(超聲頻率為25 kHz)下超聲10～90 min,超聲結(jié)束后以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液用蒸餾水稀釋10倍后通過0.22 μm尼龍濾膜進(jìn)行HPLC分析。每組試驗(yàn)3個(gè)平行,取其平均值。

1.2.4 辛弗林含量測定

1.2.4.1 色譜條件

參照Long[21]的測定方法并稍作修改:色譜柱:ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流速:1.00 mL/min;DAD檢測器;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相為甲醇:水相(含0.06%磷酸和0.06%十二烷基磺酸鈉)(58∶42);檢測波長:225 nm。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取辛弗林146 mg,置1 000 mL容量瓶中,50%甲醇溶液溶解,定容,混勻,得146 μg/mL的辛弗林標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將儲備液逐級稀釋為0.365、3.65、7.3、14.6、29.2和36.6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,搖勻過0.22 μm尼龍濾膜后按上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定,記錄對應(yīng)的色譜峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x,峰面積為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得辛弗林的回歸方程:y=1.103x+0.144,R2=0.999 8。

1.2.4.3 辛弗林得率的計(jì)算

枳實(shí)中辛弗林得率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:C——供試液的濃度,μg/mL;V——提取溶劑的體積,mL;N——稀釋倍數(shù),10;M——枳實(shí)質(zhì)量,g。

1.2.4.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理、繪圖采用OriginPro 2023、Excel 2019、SPSS 26.0、Design-Expert 13.0和ChemDraw 20.0等軟件;所有樣品平行試驗(yàn)三次,結(jié)果取其平均值。

1.2.5 DES的篩選

精密稱取枳實(shí)粉末0.1 g于50 mL離心管中,分別加入20種自制DES 10 mL,將其置于超聲波清洗器中,設(shè)定超聲功率為320 W,在室溫下超聲30 min。超聲完成后,離心,取上清液過濾進(jìn)行辛弗林含量測定。篩選出萃取效果最佳的DES后,進(jìn)一步優(yōu)化HBA/HBD的摩爾比(1∶0.5～1∶4)和含水量(10%～60%),確定DES各組分的最佳比例,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)的提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 提取工藝優(yōu)化

1.2.6.1 單因素試驗(yàn)

按照“1.2.3”的提取方法分別考察不同液料比(10、20、50、100、150、200、300 mL/g)、提取時(shí)間(10 、20、30、40、50、60 min)、超聲功率(160、240、320、400、480 W)和提取溫度(30、40、50、60 ℃)對枳實(shí)辛弗林的提取效果。

1.2.6.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對每個(gè)因素取高(1)、低(-1)2種水平,考察每種因素的影響水平及顯著性,選擇對辛弗林得率有顯著影響的因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

1.2.6.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)選擇顯著影響辛弗林得率的因素,根據(jù)各因素的正負(fù)效應(yīng),設(shè)置合適的步長和爬坡方向,有效選擇各因素具有最大響應(yīng)值的水平范圍。

1.2.6.4 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)

基于Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對辛弗林得率影響較大的液料比、超聲功率、提取時(shí)間三個(gè)因素作為自變量,以枳實(shí)辛弗林得率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 13.0 軟件中的Box-Behnken模式對其進(jìn)行工藝優(yōu)化:3因素3水平3中心點(diǎn),共17次試驗(yàn)。

1.2.7 超聲提取枳實(shí)中辛弗林過程的動(dòng)力學(xué)模型

與大部分中藥活性成分的提取過程一樣,本研究中枳實(shí)辛弗林的提取過程實(shí)質(zhì)是辛弗林從藥材細(xì)胞擴(kuò)散至DES的傳質(zhì)過程,隨著提取時(shí)間的延長,枳實(shí)內(nèi)部的辛弗林含量不斷減少,這是一個(gè)非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過程,因此本研究基于Fick第二定律對枳實(shí)辛弗林的提取動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探討。為了便于后續(xù)研究,作以下假設(shè):①枳實(shí)粉末為大小均勻的球狀顆粒;②辛弗林在枳實(shí)顆粒內(nèi)部分布均一且擴(kuò)散方向?yàn)閺较?③枳實(shí)顆粒在溶劑中分布均勻且與溶劑溫度保持一致;④枳實(shí)顆粒表面的傳質(zhì)阻力為0。

設(shè)定枳實(shí)顆粒半徑為R;枳實(shí)顆粒與溶劑的接觸面積為S;枳實(shí)顆粒內(nèi)部距表面r處在任意時(shí)刻t的辛弗林濃度為C;超聲影響下的提取擴(kuò)散系數(shù)為Du;枳實(shí)辛弗林分子本身的擴(kuò)散系數(shù)為D0;辛弗林初始濃度為C0,平衡濃度為C∞。模型表達(dá)式的具體推導(dǎo)過程可參考Gu等[22]對三七藥渣中多糖提取動(dòng)力學(xué)模型的建立。超聲輔助DES提取枳實(shí)辛弗林的動(dòng)力學(xué)過程表達(dá)式如式(3)所示。

(3)

但由于在超聲輔助提取過程中Du>>D0,故Ds=D0+Du≈Du,即有:

(4)

公式(4)即為超聲作用下枳實(shí)辛弗林的提取動(dòng)力學(xué)模型,該式可反映顆粒半徑、溫度、提取時(shí)間與辛弗林濃度間的關(guān)系。

1.2.8 超聲提取枳實(shí)中辛弗林過程的動(dòng)力學(xué)分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,測定在不同功率(160、200、240、280、320 W)、不同時(shí)間下提取液中辛弗林濃度,以驗(yàn)證所推導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)模型對該提取體系的適用性,計(jì)算提取速率常數(shù)、相對萃余率、半衰期及有效擴(kuò)散系數(shù)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES的篩選

制備的20種DES相關(guān)理化指標(biāo)見表2,體系的組成對DES電導(dǎo)率的影響有顯著差異,DES體系表現(xiàn)出比水更高的密度。一般情況下,物質(zhì)的溶解性可根據(jù)極性的“相似相溶”原理來判定,ENR值可反映DES的極性大小,ENR值越小,極性越大。溶劑的粘度是影響目標(biāo)物質(zhì)提取效果的重要因素,降低溶劑粘度可獲得更快的傳質(zhì)速率。由于辛弗林分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)存在酚羥基和氨基,故具有兩性性質(zhì),與酸堿均能結(jié)合成鹽,因此DES的pH也會顯著影響辛弗林提取效果。

表2 20種DES的極性參數(shù)、粘度、pH、電導(dǎo)率和密度

DES的種類、摩爾比和含水量對辛弗林得率的影響如圖2所示。從圖2a可知,70%甲醇的辛弗林得率為0.341 9%,DES16、DES17、DES18、DES19的辛弗林得率分別為0.396 9%、0.390 8%、0.376 9%和0.400 4% ,提取效果均顯著優(yōu)于70%甲醇,四種DES均具有強(qiáng)極性、低粘度的特點(diǎn)。盡管DES11～DES14的pH低于DES19,但由于粘度的影響而限制了對辛弗林的提取效果。最后選擇提取效果最好的DES19作為提取溶媒從枳實(shí)中提取辛弗林,進(jìn)一步考察DES19摩爾比和含水量對提取效果的影響。由圖2b可知,當(dāng)一水甜菜堿:乳酸的摩爾比為1∶3時(shí),辛弗林得率最高。從圖2c可知,含水量對辛弗林得率的整體趨勢為隨著含水量的增多先上升后下降。這可能是因?yàn)樗募尤肟娠@著降低粘度從而獲得更快的傳質(zhì)速率[10]。然而,過量的水會破壞DES的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致目標(biāo)化合物的萃取率降低[16]。因此,選擇含水量為50%的一水甜菜堿∶乳酸(1∶3)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

液料比是影響萃取工藝運(yùn)行成本的主要參數(shù),液料比過高會造成溶劑浪費(fèi),增加工藝成本。由圖3a可知,液料比為50 g/mL時(shí)辛弗林得率達(dá)到最高。由圖3b可知,隨著超聲功率的增大,辛弗林得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。適當(dāng)?shù)某暪β士捎行扑殍讓?shí)細(xì)胞壁,利于目標(biāo)物質(zhì)的溶出。當(dāng)超聲功率大于240 W時(shí),辛弗林得率隨超聲功率增強(qiáng)而降低,這可能是由于強(qiáng)烈的超聲波作用和/或熱效應(yīng)導(dǎo)致已溶出的目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生降解[17]。因此,選擇超聲波功率240 W較為適宜。由圖3c可知,提取時(shí)間為20 min 時(shí),辛弗林得率最高。隨著提取時(shí)間的延長,辛弗林得率先上升后下降。這是因?yàn)槠扑殍讓?shí)細(xì)胞壁需要一定的時(shí)間,但長時(shí)間的超聲波作用可能會破壞已經(jīng)溶出的目標(biāo)物質(zhì),從而導(dǎo)致得率降低。因此,超聲時(shí)間選擇20 min較為適宜。由圖3d可知,在所設(shè)的溫度范圍內(nèi),辛弗林得率在40 ℃處最高,這可能是因?yàn)樘岣邷囟瓤山档虳ES粘度,但過高的溫度會降解目標(biāo)物質(zhì)。在提取過程中由于超聲熱效應(yīng)會導(dǎo)致溫度升高,設(shè)定溫度與實(shí)際溫度存在偏差,因此出現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)誤差范圍波動(dòng)較大的現(xiàn)象。

圖3 不同單因素對枳實(shí)辛弗林得率的影響Fig.3 Effects of different single factors on the yield of synephrine from Aurantii Fructus Immaturus

2.2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出顯著影響因素,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3,對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,其分析結(jié)果見表4,得到4個(gè)因素和響應(yīng)值辛弗林得率的回歸方程:Y=0.393 5+0.011 3A-0.006 9B+0.007 1C-0.004 4D,其中液料比、超聲功率和超聲時(shí)間均為顯著性正效應(yīng)因素,提取溫度對辛弗林得率的影響無顯著性。

表3 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)影響因子的顯著性分析

2.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇A(液料比)、B(超聲功率)、C(超聲時(shí)間)三個(gè)顯著因素進(jìn)行正向爬坡,最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,隨著三個(gè)顯著因素逐漸增大,辛弗林得率呈先升高后降低的整體趨勢。因此,選取試驗(yàn)組2作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定關(guān)鍵變量及水平,選取對辛弗林得率影響較大的A(液料比)、B(超聲功率)、C(超聲時(shí)間)三個(gè)因素作為自變量,以辛弗林得率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 13.0 軟件中的Box-Behnken模式對其進(jìn)行工藝優(yōu)化:3因素3水平3中心點(diǎn),共17次試驗(yàn),重復(fù)3次, Box-Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸線性分析,得回歸方程:Y(%)=0.422 3-0.008 8A-0.007 9B+0.005 2C-0.017 9AB+0.003 4AC+0.009BC-0.032 8A2-0.028 1B2-0.026 3C2,其方差分析結(jié)果見表7。

表7 擬合回歸模型的方差分析

回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1,矯正決定系數(shù)AdjR2=0.988 9,變異系數(shù)CV=0.849 6%,說明模型相關(guān)度良好。通過P值判定模型顯著、失擬項(xiàng)不顯著,說明該模型穩(wěn)定性好,實(shí)驗(yàn)誤差小。根據(jù)顯著性標(biāo)準(zhǔn),一次項(xiàng)A、B、C,交互項(xiàng)AB、AC、BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對辛弗林得率均有極顯著影響(P<0.01),說明各因素對辛弗林得率的影響較復(fù)雜,不是簡單的線性關(guān)系。通過F值大小可以看出各因素對辛弗林得率的影響大小依次為A(液料比)>B(超聲功率)>C(超聲時(shí)間)。

液料比、超聲功率、超聲時(shí)間對辛弗林得率的影響及兩兩交互作用見圖4?？赏ㄟ^觀察3D響應(yīng)面圖的曲線傾斜度、等高線圖的線條密集度和扁平度來分析因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度:傾斜度越高,等高線越密集、越扁平,影響越顯著。從圖4可以看出,液料比-超聲功率和超聲功率-超聲時(shí)間的響應(yīng)面圖均有較好的傾斜度,等高線較密集且呈橢圓形,說明兩兩變量的相互作用對辛弗林得率均顯著。其中液料比和超聲時(shí)間交互作用的等高線扁平度低,因此二者的交互作用不顯著。通過Design-Expert 13.0軟件分析,得到最佳提取條件:液料比38.95 mL/g,超聲功率218.09 W,超聲時(shí)間20.37 min。

圖4 各因素對辛弗林得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of various factors on the yield of synephrine

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與對比實(shí)驗(yàn)

考慮到操作方便和實(shí)際的儀器限制,將最優(yōu)提取方案修正為液料比39 mL/g、超聲功率220 W、超聲時(shí)間20 min,在此條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),辛弗林得率分別為0.426 8%、0.429 7%、0.428 7%,平均得率為0.428 4%,與理論值0.423 0%的相對誤差為1.26%,說明采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。為進(jìn)一步證明新工藝的優(yōu)異性,將該提取方法與傳統(tǒng)提取工藝進(jìn)行了對比,結(jié)果見表8。由表8可知,不管是提取時(shí)間還是提取效果,超聲輔助深共晶溶劑提取法均優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法,說明超聲輔助深共晶溶劑提取法具有提取時(shí)間短、得率高的優(yōu)點(diǎn)。

表8 對比實(shí)驗(yàn)

2.3 超聲輔助DES提取枳實(shí)中辛弗林過程的動(dòng)力學(xué)分析

2.3.1 不同超聲功率下枳實(shí)辛弗林的提取結(jié)果

不同超聲功率下提取液中辛弗林隨提取時(shí)間的質(zhì)量濃度變化見表9,平衡濃度見表10。枳實(shí)辛弗林達(dá)到平衡濃度的時(shí)間隨著超聲功率的增大而縮短,但平衡濃度在200 W達(dá)到最高,這可能是因?yàn)檫^低的超聲功率無法使更多的辛弗林溶出,而超聲功率過高會導(dǎo)致辛弗林的降解速率高于溶出速率,因此超聲功率高于200 W時(shí)平衡濃度反而有所降低。

表9 不同超聲功率下提取液中辛弗林的濃度

表10 超聲輔助提取辛弗林的平衡濃度

2.3.2 速率常數(shù)的求解

利用表9的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對ln[C∞/(C∞-C)]與提取時(shí)間t進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見圖5和表11。由表11可知,在不同超聲功率條件所得線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均大于0.93,表明擬合精度良好。表觀速率常數(shù)k隨超聲功率增大而增大,表明超聲作用的加強(qiáng)有利于枳實(shí)辛弗林的溶出。

表11 不同超聲功率下線性回歸方程

圖5 不同超聲功率下ln[C∞/(C∞-C)]與t的關(guān)系Fig.5 The relationship between ln[C∞/(C∞-C)] and t under different ultrasound powers

2.3.3 相對萃余率的求解

在提取前枳實(shí)粉未經(jīng)浸泡,初始濃度C0=0,可設(shè)相對萃余率y=(C∞-C)/C∞,式(3)即轉(zhuǎn)化為y=(6/π2)exp(-kt),利用表9的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(C∞-C)/C∞與提取時(shí)間t進(jìn)行擬合,結(jié)果見圖6和表12。由表12可知,在不同超聲功率條件下,所得擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.93,說明擬合良好。雖然用指數(shù)方程擬合得到的速率常數(shù)與表11得到的速率常數(shù)存在一定誤差,這可能是由于使用的擬合方法不同,但速率常數(shù)隨超聲功率的變化趨勢相同,均表明超聲作用的加強(qiáng)有利于枳實(shí)辛弗林的溶出。

表12 不同超聲功率下相對萃余率對時(shí)間回歸方程

圖6 不同超聲功率下(C∞-C)/C∞與t的關(guān)系Fig.6 The relationship between (C∞-C)/C∞ and t under different ultrasound powers

2.3.4 半衰期的求解

以超聲功率P為橫坐標(biāo)、半衰期t1/2=ln2/k為縱坐標(biāo)作圖,并對其進(jìn)行線性回歸擬合,結(jié)果見圖7,得線性回歸方程t1/2=-0.005 66P+4.350 78,R2=0.884 1。半衰期表示提取枳實(shí)中一半辛弗林所需的時(shí)間,可反映提取效率的高低。由圖7可知,隨著超聲高功率的增大,其半衰期逐漸縮減,表明超聲功率越大,提取效率越高。

圖7 t1/2與超聲功率的關(guān)系Fig.7 The relationship between t1/2 and ultrasound power

2.3.5 有效擴(kuò)散系數(shù)的求解

通過速率常數(shù)可計(jì)算辛弗林提取過程中的有效擴(kuò)散系數(shù),由公式(4)可知Du=kR2/π2。枳實(shí)粉過50目(297 μm)篩,故R=0.148 5 mm。采用指數(shù)方程對Du和超聲功率P進(jìn)行擬合,結(jié)果見圖8。所得回歸方程為Du=0.463 31exp(0.006 53P)×10-4,R2=0.878 97,其擬合精度稍差,這是由于擬合時(shí)假定枳實(shí)顆粒半徑固定不變,但在實(shí)際提取過程中,超聲作用會使枳實(shí)顆粒破碎,半徑R發(fā)生改變從而導(dǎo)致擬合精度降低。

圖8 有效擴(kuò)散系數(shù)Du與超聲功率的關(guān)系Fig.8 The relationship between effective diffusion coefficient Du and ultrasonic power

3 結(jié)論

本研究首次以深共晶溶劑為提取溶媒,建立了一種從中藥枳實(shí)中提取辛弗林的超聲輔助提取方法。在所篩選的20種深共晶溶劑中,一水甜菜堿∶乳酸(1∶3)組成的DES(含水量50%)具有較優(yōu)的提取效果。最佳提取條件為:液料比為39 mL/g,超聲功率為220 W,超聲時(shí)間為20 min。在最佳提取條件下,辛弗林得率為0.428 4%。相較于常見的萃取溶劑和萃取方法,一水甜菜堿-乳酸DES萃取得率高、萃取時(shí)間短。因此該方法能成功應(yīng)用于植物基質(zhì)中辛弗林的提取,為復(fù)雜樣品中辛弗林的分析制備提供了一種可持續(xù)、安全的提取工藝,有潛力用于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。

建立植物活性成分的提取動(dòng)力學(xué)模型是定量研究其溶出規(guī)律的基礎(chǔ),本研究通過測定在不同超聲功率、不同提取時(shí)間下辛弗林的質(zhì)量濃度,以Fick第二定律為理論基礎(chǔ),建立并推導(dǎo)驗(yàn)證了超聲輔助深共晶溶劑提取枳實(shí)辛弗林的動(dòng)力學(xué)模型。對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算擬合得到動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù),隨著超聲功率的增大,速率常數(shù)增大,半衰期減小,擴(kuò)散系數(shù)增大,相對萃余率下降。研究結(jié)果可為從植物材料中提取活性成分的深入研究提供理論參考。