梁月儀,呂渭升,黃 爽,楊 潔,侯栩軒,陳志鵬,夏天睿,何廣銘

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室,佛山 528244

梅在我國的栽培歷史深遠悠久,品種復雜繁多,為多年生小喬木或灌木,其花和果實等部位均可作藥用。梅花為我國傳統(tǒng)花類藥材之一,據(jù)《本草綱目》記載:梅花性平,微酸,歸肝、胃、肺經(jīng),收載于《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》),來源為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花蕾[1]。具有疏肝和中、化痰散結的功效,常用于治療梅核氣,肝胃氣痛、郁悶心煩,食欲不佳,瘰疬瘡毒。梅在我國各地區(qū)均有栽培,而藥用梅花的道地產(chǎn)區(qū)主要為江蘇、浙江、安徽等地[2]。

目前已有約上百種化學成分可從梅花中分離得出,主要為揮發(fā)性成分、黃酮類、酚酸類、酰化類產(chǎn)物、酚苷類成分和醇苷類成分;其中酚酸類及黃酮類成分具有多方面藥理活性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抑制黑色素生成等,是梅花藥理活性的主要物質基礎[3]?，F(xiàn)行版《中國藥典》規(guī)定的含量測定指標有綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷三種成分,Zheng等[4]則以梅花中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素共6種成分的含量進行質量控制,但對其他黃酮類成分的含量尚未見報道,目前針對梅花的質量控制研究仍較為匱乏。

鑒于酚酸類、黃酮類均為梅花發(fā)揮藥效的基礎物質,本研究基于對文獻的調查,分別選取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸3種酚酸類代表性成分和金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷6種黃酮類代表性成分[5]作為質量控制指標,建立了同時測定梅花藥材中9個指標成分UPLC含量測定方法,收集45批梅花藥材,分為花蕾期、盛花期、末花期3類樣品進行測定,并對其化學成分含量的差異進行比較分析[3]。

因梅花化學成分較復雜,難以通過單一成分變化對藥材質量作出評價,而本研究中可通過同時測定多類活性成分反映不同時期含量變化而推測質量變化趨勢。根據(jù)歷代本草中記載,梅花含苞未放者與花開者質量存在差異,但目前暫未有深入報道對不同生長期的質量研究。故對梅花不同花期的質量進行對比研究,對確定梅花的采收期有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(H-class,美國沃特世公司);Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)色譜柱;百萬分之一天平(XP26型,瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑和對照品

分析級乙醇和甲醇均購自西隴科學股份有限公司,液相用磷酸、甲醇和乙腈均購自默克股份有限公司,水為超純水,由實驗室自制。

綠原酸(批號:110753-202119,含量:96.3%)、新綠原酸(批號:DSTDX001504,含量:98.0%)、隱綠原酸(批號:DST210520-017,含量:98.0%)對照品(樂美天醫(yī)藥科技有限公司);金絲桃苷(批號:111521-201809,含量:94.9%)、異槲皮苷(批號:111809-201804,含量:97.2%)、水仙苷(批號:111997-201501,含量:93.10%)、蘆丁(批號:100080-201811,含量:91.7%)對照品(中國食品藥品檢定研究院);槲皮素-3-O-新橙皮苷(批號:CFS202002,含量:98.0%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號:CFS202102,含量:98.0%)對照品(Chem Faces公司)。

1.3 藥材

實驗所用梅花藥材均由廣東一方制藥有限公司采購管理部于產(chǎn)地采集,經(jīng)廣東一方制藥有限公司質量中心檢定合格,均符合2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)“梅花”藥材項下規(guī)定,且經(jīng)孫冬梅主任中藥師鑒定為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花,藥材產(chǎn)地信息詳見表1,包括花蕾期(bud stage,BS)、盛花期(blooming period,BP)、末花期(final flowering period,FP)3類樣品。

表1 梅花樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

選擇Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)色譜柱;以甲醇-乙腈(6∶1)為流動相A,0.3%磷酸溶液為流動相B,梯度洗脫(0～10 min,13%A;10～11 min,13%→20%A;11～30 min,20%A;30～43 min,20%→28%A;43～53 min,28%→35%A),流速為0.25 mL/min;柱溫為45 ℃;檢測波長為355 nm;進樣量1 μL。

2.2 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和水仙苷對照品適量,加甲醇制成每1 mL含綠原酸140 μg、其他成分各含20 μg的混合溶液,即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取不同花期的梅花藥材粉末(粉碎:過篩用藥篩篩號為四號篩,目數(shù)為65目,篩孔內徑為250 μm±9.9 μm)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入10%甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流30 min,取出,放冷,再稱定重量,用10%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適應性試驗

按照“2.1”項下色譜條件測定混合對照品溶液、梅花樣品(FP14)供試品溶液和空白溶劑,結果表明樣品中各成分分離度與響應值均較好,且空白樣品溶液無干擾(見圖1)。

圖1 梅花藥材中9個成分含量專屬性考察圖Fig.1 Specificity investigation of nine components in Mume Flos

2.3.2 線性試驗

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和水仙苷對照品適量,制成每1 mL含新綠原酸809.382 μg、綠原酸1 392.113 μg、隱綠原酸10.408 μg、槲皮素-3-O-新橙皮苷110.054 μg、金絲桃苷558.866 μg、異槲皮苷768.074 μg、蘆丁390.459 μg、山柰酚-3-O-蕓香糖苷112.896 μg和水仙苷110.510 μg的混合對照品貯備溶液。分別精密移取上述對照品貯備溶液0.5、1.0、1.5、2.5、3.0 mL,分別置5 mL量瓶中,加甲醇制成每1 mL含新綠原酸0.080 9、0.161 9、0.242 8、0.404 7、0.485 6、0.809 4 μg,綠原酸0.139 2、0.278 4、0.417 6、0.696 1、0.835 3、1.392 1 μg,隱綠原酸0.001 0、0.002 1、0.003 1、0.005 2、0.006 2、0.010 4 μg,槲皮素-3-O-新橙皮苷0.011 0、0.022 0、0.033 0、0.055 0、0.066 0、0.110 1 μg,金絲桃苷0.055 9、0.111 8、0.167 7、0.279 4、0.335 3、0.558 9 μg,異槲皮苷0.076 8、0.153 6、0.230 4、0.384 0、0.460 8、0.768 1 μg,蘆丁0.039 5、0.078 9、0.118 4、0.197 3、0.236 8、0.394 6 μg,山柰酚-3-O-蕓香糖苷0.011 3、0.022 6、0.033 9、0.056 4、0.067 7、0.112 9 μg,水仙苷0.011 1、0.022 1、0.033 2、0.055 3、0.066 3、0.110 5 μg 的混合對照品應用液,依次精密吸取上述混合對照品貯備液和應用液各1 μL,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,以峰面積(Y)為縱坐標,以對照品濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,結果見表2所示,相關系數(shù)r均大于0.999 0,表明各成分在規(guī)定的濃度范圍內,峰面積與對照品濃度線性關系良好。

表2 各成分線性考察結果

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取同一份梅花樣品(FP14),分別于樣品制備后的0、2、4、8、12、18、24 h進樣,按“2.1”項下色譜條件測定,結果梅花樣品溶液中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積RSD值分別為2.0%、2.7%、3.0%、1.8%、2.7%、2.8%、2.0%、1.4%、0.46%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗

取同一份梅花樣品(FP14)約0.5 g,精密稱定,按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份,按“2.1”項下色譜條件測定,結果梅花樣品溶液中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的RSD值分別為0.24%、0.45%、2.6%、2.8%、0.76%、2.5%、1.8%、1.7%、2.0%,表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收試驗

分別稱取6份已知含量的梅花樣品(FP14)約0.25 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別加入一定量的綠原酸、異槲皮苷、蘆丁、新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,測定溶液中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和水仙苷含量并計算加樣回收率,結果見表3所示,均符合規(guī)定,表明該分析方法準確度良好。

表3 各成分加樣回收率測定結果

2.4 樣品測定

取45批各花期的梅花藥材粉末,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,采用外標法進行計算,45批梅花藥材中9個成分含量測定數(shù)據(jù)結果見表4。結果顯示45批梅花藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和水仙苷含量范圍分別為0.410%～1.29%、4.83%～7.66%、0.005%～0.066%、0.185%～0.508%、0.259%～0.859%、0.387%～1.18%、0.606%～1.52%、0.042%～0.127%、0.140%～0.334%,不同花期9個指標成分含量的均值對比見圖2。

圖2 不同花期梅花藥材9個指標成分含量均值占比圖Fig.2 The average proportion of nine index components in different flowering stages of Mume Flos

表4 含量測定結果

2.5 化學模式識別分析

化學計量學中的模式識別技術已廣泛應用于中藥材產(chǎn)地、基原、炮制、真?zhèn)舞b別等方面[6],分為有、無監(jiān)督兩種統(tǒng)計方法,一般先進行無監(jiān)督的HCA、PCA,觀察樣本之間是否有分類趨勢,再采用PLS-DA或者OPLS-DA進行有監(jiān)督的模式識別,顯示樣本間引起差異主要的變量,從而尋找質量差異性標志物[7]。

2.5.1 聚類分析(HCA)

以45批不同花期梅花樣品中9個成分的含量為數(shù)據(jù)源,利用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進行min～max標準化處理,再應用HemI1.0軟件以平方歐式距離進行層次聚類,見圖3,顯示所有45批樣品被聚為3類,其中15批花蕾期樣品聚為一類,主要特征為綠原酸的含量最高(范圍為6.6%～7.6%);11批末花期樣品聚為一類,主要特征為新綠原酸的含量最低(0.41%～0.77%);15批盛花期樣品以及4批末花期樣品大致聚為一類,說明通過聚類分析可大致區(qū)分花蕾期與另外兩個花期的梅花樣品。

圖3 不同花期梅花藥材中9個指標成分含量的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram of nine index components in Mume Flos medicinal materials at different flowering stages

2.5.2 主成分分析(PCA)

為了更好地將各不同花期梅花進行區(qū)分,另采用主成分分析(principal component analysis,PCA)進行分析,PCA可實現(xiàn)高維數(shù)據(jù)的降維處理,少數(shù)幾個主成分(綜合變量)即可代原始數(shù)據(jù)的大部分信息。同樣以45批不同花期梅花藥材9個成分含量為原始數(shù)據(jù),導入SIMCA14.1軟件繪制45批不同花期梅花樣品的主成分得分圖,生成3個主成分,累積貢獻率為0.973,Q2為0.928,Q2大于0.5證明模型有效,以前兩個主成分的得分值為X、Y值,生成PCA得分圖(見圖4)。結果顯示,PCA按花期的不同,將45批梅花大致分為三類,其中15批花蕾期梅花(BS1～BS15)為I類,15批盛花期梅花(BP1～BP15)為II類,15批末花期梅花(FP1～FP15)為III類。盛花期和末花期梅花在PCA得分圖上分布較為接近,而花蕾期梅花,在主成分得分上與盛花期、末花期梅花的差異較大,說明梅花在花蕾期和開花后化學成分的含量存在較大變化,該結果與聚類分析基本一致。

圖4 PCA得分圖Fig.4 PCA score diagram

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA)

為了更好地觀察不同花期梅花樣品之間的組內差異,進一步采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進行分析。以樣品FP1～FP15、BP1～BP15、BS1～BS15為Y變量,9種成分的含量為X變量,利用SIMCA14.1軟件進行OPLS-DA處理。結果在建立的偏最小二乘判別分析模型中R2X(cum)=0.971,R2Y(cum)=0.876,Q2(cum)=0.845,均大于0.5,說明建立的OPLS-DA 模型解釋率和預測力可靠、良好,見OPLS-DA得分圖5。結果顯示45批樣品分為3類,3種花期各為一類,更進一步對9個成分含量數(shù)據(jù)聚類分析結果進行分類,同時表明這9個成分在評價樣品花期之間的質量差異具有重要參考價值。同時,結合變量重要性投影值(variable importance in projection,VIP)值越大,表明對樣品分類貢獻較大;圖6其中VIP>1的有3種成分,依次為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸,說明這3種成分是影響不同花期樣品之間質量差異貢獻較大的成分,均為酚酸類成分,可作為指導梅花藥材質量控制的關鍵成分。

圖5 OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA score diagram

圖6 PLS-DA模型VIP圖Fig.6 VIP diagram of PLS-DA model

3 討論與結論

本研究含量測定結果顯示,不同花期梅花藥材中新綠原酸、綠原酸等主要酚酸類成分的含量在花蕾期最高,而絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁等黃酮類成分的含量則盛花期最高。其中酚酸類成分的含量變化與文獻報道的趨勢一致[8,9],即由花蕾期到末花期隨著花開的階段綠原酸含量有所降低。因此,造成梅花不同花期差異的主要原因為酚酸類成分的變化。

近年利用中藥多成分測定結合化學模式識別分析中藥樣品的差異,在中藥質量評價研究應用中較為廣泛[10-14]。本研究通過同時測定45批梅花藥材中9個成分含量,并結合化學模式進行分析,探索了鑒別不同花期梅花藥材的方法。在HCA分析結果中,3個花期的梅花樣品分別聚為3類,其中花蕾期梅花全部聚為一類,末花期梅花樣品大部分聚為一類,所有盛花期樣品聚為一類,結果表明梅花藥材的不同花期成分含量有明顯的差異。結合PCA和 PLS-DA 進一步分析了不同花期梅花的質量差異標志物,結果顯示,3個花期的梅花樣品均明顯位于空間的不同位置,反映了梅花樣品不同花期間的差異。同時發(fā)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸3種酚酸類成分是區(qū)分不同花期樣品貢獻較大的差異性成分,這與上述梅花不同花期主要酚酸類成分含量有所差異的結論相符。

綜上,本研究建立了梅花藥材多個成分的含量測定方法,為梅花藥材的質量標準提升提供了重要參考,同時結合化學計量學的分析,揭示了酚酸類成分在梅花不同花期間的差異,對其進行質量控制,有利于反映梅花的質量變化屬性。