何民友,王利偉,周湘媛,劉曉霞,李振雨,陳向東,孫冬梅

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室,佛山 528244

月季花又名月月紅、長春紅等,為薔薇科植物月季RosachinensisJacq.的干燥花,在我國各個地區(qū)均有種植,全年可采收,花微開時采摘,陰干或低溫干燥。月季花藥用價值最早記載于李時珍的《本草綱目》,其味甘,性溫,歸肝經(jīng);具有活血調(diào)經(jīng)和疏肝解郁的功效,主要用于氣滯血瘀、月經(jīng)不調(diào)、胸脅脹痛等癥候諸疾的治療[1-3]。月季花含有多種化學(xué)成分,包括黃酮類、酚酸類、芳香油、鞣質(zhì)和色素等,其中黃酮類和酚酸類被認為是月季花的主要藥效成分[4,5]。黃酮類成分占主要成分,包括槲皮苷、槲皮素、山柰素-3-O-鼠李糖苷、山柰黃素、琥珀酸、沒食子酸、沒食子酸乙酯、金絲桃苷、胡桃苷、異槲皮苷等[6,7],具有抗病毒、抗氧化、增強機體免疫及抗癌等生物活性[8-10]。

中藥成分復(fù)雜,其發(fā)揮藥效作用的基礎(chǔ)是多種有效成分之間多靶點、多途徑及整體性的相互協(xié)同作用,發(fā)揮對機體的調(diào)節(jié)作用[11]。中藥指紋圖譜建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,從物質(zhì)群出發(fā)將中藥成分信息全面展現(xiàn),以反映中藥化學(xué)成分的整體情況,一種綜合的,可量化的有效技術(shù)手段[12]。本研究通過UPLC法建立20批月季花標準湯劑的指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù),分析探討影響月季花標準湯劑的主要特征成分,并進行多指標成分定量分析,以期為月季花標準湯相關(guān)制劑開發(fā)、質(zhì)量標準研究提供參考。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher QE高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀、Compound Discoverer 2.1質(zhì)譜分析軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司);Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱;XP 26型百萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑

甲醇、乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)為分析純;色譜磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、色譜乙腈(德國默克公司)。

1.3 試藥

沒食子酸(批號:110831-201906,含量:91.5%)、鞣花酸(批號:111959-201903,含量:88.8%)、金絲桃苷(批號:111521-201809,含量:94.9%)、異槲皮苷(批號:111809-201804;含量:97.2%)、槲皮苷(批號:111538-202007;含量:93.5%)和槲皮素(批號:100081-201610;含量:99.1%)對照品(中國食品藥品檢定研究院);紫云英苷(批號:DSRDZ 000101,含量:99.19%)、阿福豆苷對照品(批號:DSTDA 002901,含量:99.85%)(上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司)。

本實驗通過實地采集20批月季花藥材,經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為薔薇科植物月季RosachinensisJacq.的干燥花,經(jīng)質(zhì)量中心按《中華人民共和國藥典》(2020年版)月季花項下性狀、鑒別、檢查、含量測定進行檢驗,所采集樣品均符合性狀、顯微、薄層、水分、灰分、重金屬、農(nóng)藥殘留、含量測定等相關(guān)規(guī)定,樣品信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 月季花飲片標準湯劑制備

依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》和《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中相關(guān)規(guī)定,通過考察后確定月季花標準湯劑的制備工藝為:取月季花飲片100 g,加水煎煮兩次,一煎加12倍量水,浸泡30 min,煎煮30 min,二煎加10倍量水,煎煮25 min,趁熱過濾,濾液迅速用冷水冷卻,合并兩次濾液。減壓濃縮至約150 mL,冷凍干燥,制得月季花標準湯劑凍干粉。

2.2 供試品溶液的制備

取月季花標準湯劑凍干粉適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 對照品溶液的制備

取沒食子酸對照品、鞣花酸對照品、金絲桃苷對照品、異槲皮苷對照品、紫云英苷對照品、槲皮苷對照品、阿福豆苷對照品和槲皮素對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成每1 mL含沒食子酸、鞣花酸各50 μg,金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷各20 μg,阿福豆苷、槲皮素各10 μg的混合對照品溶液,即得。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 色譜條件

采用Agilent SB C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱;流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫:0～1 min,3%A;1～2 min,3%→10%A;2～8 min,10%→11%A;8～11 min,11%→15%A;11～14 min,15%A;14～16 min,15%→19%A;16～19 min,19%A;19～25 min,19%→40%A;體積流量為0.40 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長254 nm;進樣量2 μL;按鞣花酸峰計算理論塔板數(shù)不低于5 000。

2.4.2 質(zhì)譜條件

流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫條件同“2.4.1”項。采用電噴霧離子源(ESI),噴霧電壓為3.20 kV,正、負離子模式掃描。離子源主要參數(shù):離子源溫度為300 ℃,脫溶劑溫度為250 ℃,脫溶劑氣流為5 L/min,毛細管電壓為3.5 kV,錐孔電壓為80 V,碰撞能量為40 eV;正、負離子的采集范圍為m/z120～1 000。

2.4.3 精密度試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,以鞣花酸對照品相對應(yīng)的色譜峰為參照峰S,計算得到各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.070%～0.24%和0.16%～0.61%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、18、24 h進樣測定,以鞣花酸對照品相對應(yīng)的色譜峰為參照峰S,計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.13%～0.83%和0.31%～1.1%,均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 重復(fù)性試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,平行6份,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析,以鞣花酸對照品相對應(yīng)的色譜峰為參照峰S,計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.12%～0.86%和0.27%～1.8%,均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立和化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰標定

分別取20批月季花標準湯劑凍干粉適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備20份供試品溶液,分別按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定,記錄各批次月季花標準湯劑樣品的指紋圖譜,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》進行數(shù)據(jù)處理。設(shè)定S1為參照圖譜,采用平均數(shù)法,進行多點校正和全譜峰匹配,20批月季花標準湯劑指紋圖譜確立了15個共有峰,以中位數(shù)法生成月季花標準湯劑對照指紋圖譜(見圖1)。

圖1 20批月季花標準湯劑UPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprint of 20 batches of standard decoction of RCF and reference fingerprint

2.5.2 主要化合物的確證

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.2”項下色譜條件用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-HRMS系統(tǒng)測定,分別采集供試品溶液在正、負離子模式下總離子流圖(TIC)及紫外吸收色譜圖(見圖2)。采用Compound Discoverer 2.1分析軟件對采集的質(zhì)譜圖進行分析,通過確定目標化合物的精確分子量和碎片離子信息對比,結(jié)合mzCloud標準數(shù)據(jù)庫和自建數(shù)據(jù)庫進行對比,指認出1號峰為沒食子酸,6號峰為鞣花酸,7號峰為金絲桃苷,8號峰為異槲皮苷,10號峰為紫云英苷,11號峰為槲皮苷,13號峰為阿福豆苷,15號峰為槲皮素?；衔镄畔⒁姳?。對質(zhì)譜指認的化合物通過對照品保留時間及吸收光譜進一步確證,結(jié)果與指認一致(見圖3)。

圖2 月季花標準湯劑正(A)、負(B)離子模式TIC和紫外色譜圖(C)Fig.2 TIC in positive (A) and negative (B) ion mode and UV chromatogram (C) of standard decoction of RCF

圖3 混合對照品(Ⅰ)和月季花標準湯劑(Ⅱ)色譜圖Fig.3 Chromatograms of mixed reference (Ⅰ) and standard decoction of RCF (Ⅱ)

表2 月季花標準湯劑指紋圖譜共有峰的質(zhì)譜指認結(jié)果

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價

將“2.5.1”項下采集的20批月季花標準湯劑指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)進行全譜峰匹配,生成相對應(yīng)的對照圖譜,計算月季花標準湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,20批樣品的相似度在0.983～0.999,說明月季花標準湯劑在制備過程中各工藝穩(wěn)定可靠,可用于月季花標準湯劑的質(zhì)量評價。

表3 相似度評價結(jié)果

2.5.4 聚類分析

以共有峰的相對峰面積為變量,采用SPSS 25.0軟件,以組間鏈接結(jié)合平方歐式距離(d)為樣本測度的系統(tǒng)聚類法進行分析,建立月季花標準湯劑的聚類分析譜系圖(見圖4)[13]。HCA結(jié)果表明,當組間距離為15時,20批月季花標準湯劑聚為四類,S1～S6為第一類,S7～S10為第二類,S11～S13為第三類,S14～S20為第四類。聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)結(jié)果顯示,云南、河北、河南、山東4個產(chǎn)地樣品各自歸為一類,說明各批次月季花標準湯劑與產(chǎn)地存在一定的關(guān)聯(lián),同一產(chǎn)地樣品差異不明顯,不同產(chǎn)地樣品存在一定差異。

圖4 20批月季花標準湯劑聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of 20 batches of standard decoction of RCF

2.5.5 主成分分析

為進一步探究月季花標準湯劑質(zhì)量穩(wěn)定性差異的原因,以20批標準湯劑共有峰的相對峰面積為變量,使用SIMCA 14.1軟件進行無監(jiān)督模式識別方法主成分分析觀察樣品的自然聚集(見圖5)[14],生成4個主成分,累計貢獻率為96.1%,Q2為0.832(>0.5),將樣品分為3類,S1～S6為第一類,S7～S10為第二類,S11～S13為第三類,S14～S20為第四類,主成分分析(principal component analysis,PCA)結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致,進一步證明前4個主成分可代表樣品的整體質(zhì)量情況,通過指紋圖譜各色譜峰相對峰面積可以將不同產(chǎn)地樣品進行分類。

圖5 20批月季花標準湯劑主成分分析Fig.5 PCA of 20 batches of standard decoction of RCF

2.5.6 正交偏最小二乘法-判別分析

基于HCA和PCA分析表明,不同產(chǎn)地的月季花標準湯劑存在質(zhì)量穩(wěn)定性差異。采用可消除無關(guān)噪音的正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)對HCA和PCA的分析結(jié)果做進一步分析,以確定導(dǎo)致月季花標準湯劑質(zhì)量差異的主要標志物并進行控制[15]。

建立的OPLS-DA模型共篩選4個主成分,其R2Y為0.883和Q2為0.800,均大于0.5且接近1,表明該模型穩(wěn)定性和預(yù)測能力均較好。200次置換檢驗結(jié)果表明,R2與Y軸正半軸的截距為0.032 5(<0.4)和Q2與Y軸負半軸的截距為-0.692(<-0.05),證明建立的模型穩(wěn)定有效,不存在過擬合情況,可進一步應(yīng)用于月季花標準湯劑質(zhì)量穩(wěn)定性差異標志物的篩選(見圖6)[16]。進一步進行OPLS-DA,結(jié)果表明OPLS-DA得分模型中(見圖7),4組樣品聚類良好,分離更加顯著,與HCA、PCA結(jié)果一致,從而進一步驗證了分析的合理性。變量重要性投影值(variable importance in projection,VIP)是OPLS-DA模型篩選潛在差異標志物最重要的分析,成分指標VIP值越大,表示其對于解釋變量的貢獻越大和差異相關(guān)性越高[17]。以VIP值>1和P<0.05為標準,共篩選得到11個質(zhì)量差異標志物的共有峰(見圖8),按VIP大小順序依次為4號峰>14號峰>1號峰(沒食子酸)>9號峰(異槲皮苷)>11號峰(槲皮苷)>13號峰(阿福豆苷)>7號峰(鞣花酸)>8號峰(異槲皮苷)>15號峰(槲皮素)>10號峰(紫云英苷)>5號峰,這些成分可能是導(dǎo)致不同產(chǎn)區(qū)月季花標準湯劑質(zhì)量穩(wěn)定性差異的主要原因。為確保月季花標準湯劑的藥效成分質(zhì)量穩(wěn)定性,在建立質(zhì)量標準時可選取以上差異標志性成分作為定量控制指標進行控制,為月季花標準湯劑的質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。

圖6 OPLS-DA模型置換檢驗圖Fig.6 OPLS-DA model permutation test diagram

圖7 OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA scores diagram

圖8 OPLS-DA模型VIP圖Fig.8 VIP diagram of OPLS-DA model

2.6 多成分含量測定

2.6.1 精密度試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素所對應(yīng)的色譜峰的峰面積,并計算峰面積RSD依次為0.11%、0.82%、0.34%、0.61%、0.57%、0.05%、0.58%、0.36%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.6.2 線性關(guān)系考察

取沒食子酸對照品、鞣花酸對照品、金絲桃苷對照品、異槲皮苷對照品、紫云英苷對照品、槲皮苷對照品、阿福豆苷對照品和槲皮素對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成濃度分別為96.350、91.597、98.222、101.477、99.388、98.222、103.694、99.546 μg/mL的混合對照品儲備液。精密吸取上述對照品0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL分別置10 mL量瓶中,加入50%甲醇定容至刻度,即得線性各濃度點。按“2.4.1”項下色譜條件連同儲備液依次進樣2 μL,記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(Y),對照品濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線(見表4)。結(jié)果表明,8種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999),可準確定量待測成分。

表4 8種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.6.3 穩(wěn)定性試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、18、24 h進樣測定,記錄沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素所對應(yīng)的色譜峰的峰面積,并計算峰面積RSD依次為0.86%、1.0%、1.3%、0.47%、1.4%、1.9%、0.44%、2.2%,均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗

取月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)適量,研細,取約0.2 g,精密稱定,平行6份,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析,計算得到?jīng)]食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素的含量依次為25.68、5.75、7.19、5.70、2.00、8.05、3.46、0.18、0.11 mg/g,RSD均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.6.5 加樣回收率試驗

取同一批月季花標準湯劑凍干粉(編號:S8)6份,每份約0.1 g,精密稱定,加入濃度分別為51.360、11.502、14.381、11.413、4.018、16.109、6.924、0.362、0.223 μg/mL的沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素的混合對照品溶液50 mL,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析,計算得到?jīng)]食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素的平均加樣回收率依次為98.24%、97.89%、101.05%、103.40%、98.47%、98.05%、99.06%、100.18%、99.13%,RSD依次為0.89%、0.75%、1.1%、2.0%、1.5%、0.57%、1.4%、1.6%,均小于3.0%,加樣回收率符合《中國藥典》的9101回收限度標準,表明建立的含測方法回收率良好和準確度高。

2.6.6 樣品含量測定

取20批月季花標準湯劑凍干粉,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析,計算沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素的含量,結(jié)果見表5。結(jié)果顯示,河南省周口市的月季花原料制備的標準湯劑金絲桃苷、槲皮素和阿福豆苷含量與其他產(chǎn)地差異不顯著,但沒食子酸、鞣花酸、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素含量均顯著高于其他產(chǎn)地的樣品。

表5 20批月季花標準湯劑中各化合物含量測定結(jié)果(n = 3)

3 討論與結(jié)論

為保證標準湯劑的代表性,本研究對月季花原料藥材主產(chǎn)地信息進行了調(diào)研,共收集20批樣品,實地取樣包括河北省保定市、河南省周口市、山東省菏澤市、山東省臨沂市、云南省大理州等主產(chǎn)地和道地產(chǎn)地。根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》的指導(dǎo)原則,并參照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》對標準湯劑的前處理方法(煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時間等指標和參數(shù))進行工藝考察,確定最佳的制備工藝;采用低溫濃縮和冷凍干燥,制成月季花標準湯劑凍干粉。

在指紋圖譜方法建立的過程中,考察了供試品的提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇)、提取方式(超聲、回流)和提取時間(10、30、45、60 min)對指紋圖譜的影響。從提取充分性、穩(wěn)定性及操作簡便性等考慮,最終選擇50%甲醇超聲處理30 min。采用二極管陣列檢測器對月季花標準湯劑樣品進行全波長掃描(200～400 nm),比較不同波長下色譜圖的峰數(shù)、響應(yīng)值及分離度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用254 nm作為檢測波長的色譜峰數(shù)較多且響應(yīng)值較大,基線平穩(wěn),干擾較小。同時對色譜條件的流動相水相、柱溫及流速等進行了考察,最終確定以0.2%磷酸溶液為流動相的水相,流速為0.4 mL/min,柱溫為35 ℃。

采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對不同產(chǎn)地月季花標準湯劑進行分析比較,結(jié)果表明,無監(jiān)督的HCA和PCA分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的樣品可聚4類。OPLS-DA分析共篩選得到11個差異標志物,其主要為黃酮類和酚酸類成分,對于區(qū)分不同產(chǎn)地的月季花標準湯劑起到了重要作用,可作為月季花標準湯劑的質(zhì)量控制指標,為月季花配方顆粒的原料來源提供更為全面地參考。

本研究采用指紋圖譜結(jié)合聚類、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析并結(jié)合多指標成分含量測定,對20批月季花標準湯劑質(zhì)量進行了初步研究,該方法可以較快地篩選出影響不同批次藥材質(zhì)量的關(guān)鍵色譜峰,其中通過高分辨及對照品光譜比對指認出沒食子酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷和槲皮素。結(jié)果表明,酚酸類及黃酮類成分含量較高的均為河南省采集樣品,歸屬HCA和PCA分析中的S11～S13,含量最低的均為云南省采集樣品,歸屬第一類S1～S6?？蔀楹罄m(xù)月季花標準湯劑的原料藥采集產(chǎn)地的選擇提供依據(jù)。目前研究顯示,月季花主要含有黃酮類、黃酮苷類和酚酸類化合物,有抗氧化、抗病毒、抗真菌、抗癌、抗腫瘤和抗衰老等生物活性[10,18],后期將結(jié)合藥效進行深入研究,為月季花標準湯劑及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。