梅 菊,吳 濤,李 強,劉 洋,殷 濤,廖香蓮,2,孫代華,胡力飛,3*

1湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心,黃石 435100;2湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黃石 435002;3湖北工業(yè)大學(xué)教育部工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430068

肉桂為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹皮,多于春、秋季剝?nèi)?陰干,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為我國應(yīng)用非常廣泛的藥食同源藥材,有“補火助陽,引火歸元,散寒止痛,溫通經(jīng)脈”的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,肉桂具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、減輕胃損傷、改善學(xué)習(xí)記憶能力等多種藥理作用[2-12];肉桂中含有揮發(fā)油、黃酮、倍半萜、多糖等多種成分,其中揮發(fā)性成分為其主要功效成分[13];作為有祛寒作用的傳統(tǒng)中藥,肉桂還可激活棕色脂肪組織,通過上調(diào)產(chǎn)熱蛋白的表達(dá)顯著增加非寒顫產(chǎn)熱[14,15]。

肉桂的炮制方法為除去雜質(zhì)及粗皮?！独坠谥苏摗贰侗静萁?jīng)集注》《太平圣惠方》明確了去粗皮、去削上虛軟甲錯、去皺皮等制法,《太平惠民和劑局方》則稱“去皮,不見火”,稱肉桂去皮與否視功效而定[16]。肉桂去粗皮前后的功效往往與其中的化學(xué)成分相關(guān),本文主要以廣東陽春、云浮、肇慶及廣西防城港、貴港的肉桂為研究對象,通過多指標(biāo)成分評價肉桂原料產(chǎn)地,并對不同產(chǎn)地肉桂炮制過程中的成分變化進行分析,可為肉桂產(chǎn)地選擇、質(zhì)量評價等研究工作提供參考。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

本次研究所用28批不同產(chǎn)地肉桂藥材由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司高級工程師殷濤于2022年11月采集,具體采集產(chǎn)地信息見表1,樣本經(jīng)湖北師范大學(xué)張新潮副教授鑒定均為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹皮。

表1 肉桂樣品產(chǎn)地信息

1.2 實驗試劑

乙腈(色譜級,美國Fisher chemical公司);香豆素(批號:240034-202111,含量98.00%,上海鴻永生物科技有限公司);肉桂醇(批號:180011-202207,含量99.67%,上海鴻永生物科技有限公司);肉桂酸(批號:110786-201604,含量98.80%,中國食品藥品檢定研究院);桂皮醛(批號:110710-202223,含量98.80%,中國食品藥品檢定研究院);2-甲氧基桂皮醛(批號:AF21060951,含量99.84%,成都埃法生物科技有限公司);水為超純水;其余試劑為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫有限公司);Agilent ZORBAX SB-Aq RRHT液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)(美國安捷倫有限公司);XS-105DU電子分析天平(梅特勒托利多科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq RRHT(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～4 min,15%→22%A;4～6 min,22%A;6～12 min,22%→55%A);檢測波長為265 nm;進樣量2 μL;流速為0.4 mL/min;柱溫30 ℃。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 供試品溶液制備

取肉桂藥材粉末(過3號篩)約 0.10 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率350 W,頻率35 kHz)30 min,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.1.2.2 對照品溶液制備

精密稱取香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛對照品10.98、11.61、10.30、49.01、11.10 mg至10、10、10、50、10 mL容量瓶中,加甲醇配成香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛濃度分別為1.076、1.157、1.018、0.969 4、1.108 mg/mL的對照品儲備液;分別精密吸取5個對照品儲備液1、1、1、10、4 mL置20 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品工作液。

2.1.3 專屬性試驗及共有峰的指認(rèn)

精密吸取供試品(S1)、對照品、空白溶液(70%甲醇溶液)適量,在“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,結(jié)果如圖1。由此可知,各成分色譜峰分離度均大于1.5,空白無干擾,表明該方法專屬性良好。與對照品保留時間比對,確認(rèn)峰6～10分別為香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛。

圖1 對照品及肉桂樣品UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances and Cinnamomi Cortex sample

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗

取肉桂供試品(S1)粉末,按“2.1.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定6次,以峰9(桂皮醛)為參照峰S,結(jié)果顯示各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.02%～0.95%和0.11%～1.0%,均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗

取同一批肉桂供試品(S1)粉末,按“2.1.2.1”項下方法制備成6份供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定,以峰9(桂皮醛)為參照峰S,結(jié)果顯示各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.02%～1.0%和0.15%～1.1%,均小于2.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4.2”項下供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件分別在 0、2、4、6、8、10、24 h測定,以峰9(桂皮醛)為參照峰S,結(jié)果顯示各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.03%～0.29%和0.17%～1.2%,均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 相似度評價

取28批肉桂樣品按上述方法測定并記錄色譜圖,將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,采用中位數(shù)法及多點校正后進行色譜峰匹配,共標(biāo)定了10個共有峰,分別生成肉桂樣品的疊加圖譜和對照指紋圖譜(見圖2)。與對照品比對指認(rèn)了其中5個色譜峰,分別為香豆素(6號峰)、肉桂醇(7號峰)、肉桂酸(8號峰)、桂皮醛(9號峰)、2-甲氧基桂皮醛(10號峰)。計算28批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度,相似度均在0.996及以上(見圖3),表明各批樣品有較好的一致性,所建立的指紋圖譜可用于評價肉桂的質(zhì)量。

圖2 28批肉桂UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of 28 batches of Cinnamomi Cortex

圖3 28批肉桂UPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果Fig.3 UPLC fingerprint similarity evaluation results 28 batches of Cinnamomi Cortex

2.2 化學(xué)計量學(xué)研究

2.2.1 聚類分析(CA)

以共有峰面積為變量,采用OriginPro 2023軟件將28批肉桂的共有峰面積進行聚類分析,以ward聚類方法結(jié)合Euclidean距離計算對28批肉桂樣品進行聚類分析,以ward聚類方法結(jié)合Pearson相關(guān)性對10個共有峰進行聚類分析,聚類分析結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,樣品可被分為3類,大部分防城港樣本(S19～S22、S24)及肇慶市高要區(qū)樣本(S14、S16～S18)及其他少量樣本聚為一類,大部分廣西貴港樣本(S26～S28)和部分廣東云浮(S5、S7、S8)、廣東肇慶樣本(S10、S11)聚為一類,廣東陽春樣本(S1～S3)與其他樣本(S12、S23、S25)聚為一類,其中廣東陽春、肇慶市高要區(qū)及廣西防城港、貴港樣品分類較為集中,而廣東云浮市和肇慶市德慶縣樣品分類相對分散。10個峰可被分為4個組別,香豆素和2-甲氧基桂皮醛聚為一組,肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛聚為一組,峰2～5聚為一組,峰1為一組;從聚類熱圖中可見,原料分類與聚為一類的色譜峰有一定相關(guān)性,表明不同產(chǎn)地肉桂原料存在一定成分差異,可通過所含化學(xué)成分進行區(qū)分。

圖4 28批肉桂聚類分析評價結(jié)果Fig.4 Evaluation results of cluster analysis of 28 batches of Cinnamomi Cortex

2.2.2 主成分分析(PCA)

采用Origin Pro 2023軟件對10個共有峰面積進行主成分分析,計算相關(guān)矩陣的特征值、特征向量和分值。確定了特征值>1的4個主成分,4個主成分的累計方差貢獻率為87.15%,并以PC1、PC2、PC3繪制28批次肉桂樣本的雙標(biāo)圖(見圖5)。第一主成分(PC1)解釋了總方差的39.19%,信息主要來自于峰2～5及香豆素,與這幾個成分均呈正相關(guān);第二個主成分(PC2)解釋了總方差的24.21%,信息主要來自于肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛,并均呈正相關(guān);第三個主成分(PC3)解釋了總方差的12.72%,信息主要來自于峰1、香豆素和2-甲氧基桂皮醛,與峰1呈正相關(guān),與香豆素和2-甲氧基桂皮醛呈負(fù)相關(guān);第四個主成分(PC4)解釋了總方差的11.03%,信息主要來自于峰1且呈正相關(guān)。廣西防城港、貴港、廣東陽春及部分肇慶樣本分布較為集中,云浮及部分肇慶樣本分布相對分散,但分布仍有一定規(guī)律,可能受其他相近的樣本的影響了其分類,而各變量主成分載荷情況則與“2.2.1”中色譜峰的聚類分析結(jié)果相似;肉桂樣本主成分分析情況與聚類分析結(jié)果相近。

圖5 PCA雙標(biāo)圖Fig.5 PCA biplot

2.2.3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

采用SIMCA14.1軟件對樣本及10個共有峰變量進行OPLS-DA分析,結(jié)果表明,通過OPLS-DA,各市縣分類模型擬合效果不佳,但可實現(xiàn)對廣東、廣西兩省肉桂的有效區(qū)分。分析中的自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.864,因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.833,模型預(yù)測指數(shù)(Q2)為0.629,R2和Q2均超過了0.5,表明該模型擬合結(jié)果可接受;同時通過200次置換檢測,Q2回歸線與縱軸的相交點小于0,說明模型不存在過擬合,所建立的模型有效,認(rèn)為該結(jié)果可用于肉桂產(chǎn)地對比分析,相關(guān)分析結(jié)果如圖6、圖7所示。結(jié)果表明,OPLS-DA將肉桂樣本分為兩類,所生成的變量VIP圖8所示,并以VIP大于1為閾值,篩選出5個貢獻值較大的成分,依次為香豆素、峰3、峰5、2-甲氧基桂皮醛和峰2,判斷其為區(qū)分廣東、廣西樣本的代表性差異成分;成分差異可能與兩省藥材種植環(huán)境的不同相關(guān)。

圖6 OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA scrore plot

圖7 OPLS-DA模型置換驗證圖Fig.7 OPLS-DA model permutation test diagram

圖8 OPLS-DA模型VIP值Fig.8 VIP value of OPLS-DA model

2.3 藥材含量測定

結(jié)合上述分析及峰面積情況,確定對肉桂中香豆素、2-甲氧基桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛5個成分進行含量測定。

2.3.1 線性關(guān)系考察

將“2.1.2.2”項下混合對照品工作液分別稀釋2、5、10、50、200、1 000倍后各進樣2 μL,進樣測定,記錄5個成分峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制曲線方程,得到5個成分的回歸方程及線性范圍,結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗

取肉桂供試品(S1)粉末,按“2.1.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定6次,記錄香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛的峰面積,并計算峰面積RSD值分別為0.60%、1.4%、0.51%、1.8%和0.40%,表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取同一肉桂供試品(S1)粉末6份,按“2.1.2.1”項下方法制備成6份供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進行測定,記錄5個成分的峰面積,測定含量并計算RSD值,5種成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.81、0.04、0.29、26.26、4.93 mg/g,RSD分別為0.33%、3.6%、0.46%、1.3%、0.59%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取肉桂供試品(S1)粉末,按“2.1.2.1”項下方法制備成供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定,記錄5個成分的峰面積并計算RSD值,結(jié)果顯示5個成分RSD值分別為0.59%、1.1%、0.52%、0.19%、0.20%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

稱取同一肉桂供試品粉末(S1)0.05 g共6份,精密稱定,分別加入含香豆素0.053 8 mg/mL、肉桂醇0.002 3 mg/mL、肉桂酸0.030 6 mg/mL、桂皮醛1.454 1 mg/mL、2-甲氧基桂皮醛0.277 1 mg/mL的混合對照品溶液1 mL,按“2.1.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進行測定,計算5個成分的加樣回收率及RSD值,結(jié)果見表3。結(jié)果表明5個成分的平均回收率為97.65%～103.4%,其RSD均在1.2%～2.5%之間,可以滿足5個成分的含量測定要求。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.6 藥材及飲片含量測定

取肉桂藥材樣品按《中華人民共和國藥典》(2020年版)第一部肉桂項下要求除去粗皮,28批飲片的得率范圍為91.85%～97.39%之間(每批約150 0 g),將炮制前后的藥材及飲片分別按“2.1.2.1”項下方法制備成供試品溶液,每批樣品平行兩份,按“2.1.1”項下色譜條件進行含量測定,采用外標(biāo)一點法計算香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛的含量。同時,取約20 g通過2號篩至3號篩的肉桂粉末,每批樣品平行兩份,采用《中華人民共和國藥典》(2020年版)揮發(fā)油測定法項下乙法測定其揮發(fā)油量,計算肉桂中揮發(fā)油含量。

5個成分及揮發(fā)油含量測定結(jié)果及對比情況見表4及圖9。其中各批次藥材和飲片中5個成分及揮發(fā)油含量雖略有差異,但各指標(biāo)含量均值較為相近。其中5個成分的含量平均值由高到低均為桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛、香豆素、肉桂酸和肉桂醇;同時各批次間桂皮醛、肉桂酸和肉桂醇的整體變化趨勢相近,2-甲氧基桂皮醛和香豆素的變化趨勢相近,與前期共有峰分類結(jié)果一致。

圖9 肉桂藥材和飲片多指標(biāo)成分含量對比圖Fig.9 Comparison of multi-index components content of Cinnamomi Cortex medicinal materials and decoction pieces

表4 肉桂樣本炮制前后含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究采集了廣東、廣西共7個縣/市28批肉桂樣品,采用UPLC法建立了肉桂樣品的指紋圖譜,各批次肉桂樣品與對照圖譜的相似度在0.996及以上,相似度良好,所建立的指紋圖譜可用于評價肉桂的質(zhì)量。采用Origin Pro 2023軟件以10個共有峰面積為變量對28批肉桂進行聚類分析和主成分分析,聚類分析表明樣本可分為3類,其中廣東陽春、肇慶市高要區(qū)及廣西防城港、貴港樣本分類較為集中,而廣東云浮市和肇慶市德慶縣樣本分類相對分散,10個共有峰被分為4類,香豆素和2-甲氧基桂皮醛聚為一類,肉桂醇、肉桂酸和桂皮醛聚為一類,峰2～5聚為一類,峰1為一類,原料分類與峰的分類有一定相關(guān)性,不同產(chǎn)地肉桂原料存在一定差異,可通過所含化學(xué)成分進行區(qū)分;主成分分析確定了4個主成分,第一主成分的信息主要來自于峰2～5,第二個主成分的信息主要來自于肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛,第三個主成分的信息主要來自于香豆素和2-甲氧基桂皮醛,第四個主成分的信息來(PC4)主要自于峰1,得分圖顯示其中廣西防城港、貴港、廣東陽春及部分肇慶樣本分布較為集中,云浮及部分肇慶樣本分布相對分散,但各產(chǎn)地分布仍有一定規(guī)律,各主成分的信息來源及得分圖結(jié)果與聚類分析結(jié)果相似。同時,采用SIMCA14.1軟件對10個共有峰變量進行了OPLS-DA分析,可實現(xiàn)對廣東、廣西兩省肉桂的有效區(qū)分,篩選出5個對產(chǎn)地區(qū)分貢獻值較大的成分(香豆素、峰3、峰5、2-甲氧基桂皮醛和峰2),成分的差異可能與產(chǎn)地的種植環(huán)境不同相關(guān)。并結(jié)合峰面積情況確定對肉桂中的香豆素、2-甲氧基桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛5個成分進行了UPLC含量測定。

含量及揮發(fā)油測定結(jié)果表明,肉桂炮制前后5個成分及揮發(fā)油含量均值較為相似,肉桂“去皮,不見火”的原因與桂皮醛等酚類成分及揮發(fā)油的相關(guān)性較低;且各批次間桂皮醛、肉桂酸和肉桂醇的整體變化趨勢相近,2-甲氧基桂皮醛和香豆素的變化趨勢相近,與前期共有峰分類結(jié)果一致。

綜上所述,本研究建立了肉桂UPLC指紋圖譜方法,采用化學(xué)計量方法對各產(chǎn)地藥材及共有峰進行了分析,建立了5個成分的含量測定方法,并對藥材炮制前后的成分差異進行了對比研究,以期為肉桂藥材的產(chǎn)地選擇、質(zhì)量研究提供參考。