謝 景,秦 優(yōu),唐雪陽(yáng),沈冰冰,王勇慶,陳 林,張水寒*

1湖南省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所,長(zhǎng)沙 410013;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208

前胡藥材來(lái)源于傘形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根,始載于《名醫(yī)別錄》,具有疏散風(fēng)熱、降氣化痰的功效,常用于痰熱咳喘、咯痰黃稠、風(fēng)熱咳嗽痰多等癥[1]。在現(xiàn)代化學(xué)成分和臨床應(yīng)用上,前胡活性成分主要為角型吡喃香豆素,包括白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡丁素等,具有祛痰平喘、抗心衰、降血壓、抗炎等藥理作用[2,3]。自古以來(lái),前胡藥材以野生資源為主,分布于安徽、湖南、江西、浙江、江蘇等地。近年來(lái),因資源需求激增,人工種植逐漸代替野生,其栽培主產(chǎn)區(qū)主要為安徽寧國(guó)、湖南華容、貴州遵義、重慶奉節(jié)等地[4]。白花前胡實(shí)現(xiàn)人工種植后,各產(chǎn)地紛紛引種種植,種植區(qū)域東至浙江,西至云南、四川,但因產(chǎn)地環(huán)境千差萬(wàn)別,前胡藥材質(zhì)量存在較大差異,品質(zhì)良莠不齊[3]。此外,加上人工種植白花前胡容易發(fā)生早薹等[5,6]問(wèn)題,迫使前胡藥材提前采收,生長(zhǎng)年限不足致使藥材不合格率大幅上升。2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定“白花前胡甲素不得少于0.90%,白花前胡乙素不得少于0.24%”,但市場(chǎng)上前胡藥材質(zhì)量達(dá)標(biāo)率僅26%,不合格前胡藥材充斥市場(chǎng)[7]。前胡藥材質(zhì)量保障除了培育高品質(zhì)新品種、形成適宜種植技術(shù)、規(guī)范產(chǎn)地初加工外,客觀、科學(xué)、合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法及標(biāo)準(zhǔn)也是其重要內(nèi)容。目前,前胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)關(guān)鍵在于白花前胡甲素、乙素含量高低,但這往往不能從整體評(píng)價(jià)前胡藥材的內(nèi)在品質(zhì),直接影響了中醫(yī)臨床應(yīng)用。

HPLC指紋圖譜能較全面反映藥材內(nèi)在質(zhì)量,是共識(shí)度較高的質(zhì)控手段,結(jié)合多指標(biāo)含量測(cè)定,現(xiàn)已成為中藥材質(zhì)量控制的主流[8,9]。聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)等非監(jiān)督方法和偏最小二乘法(partial least squares method,PLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等有監(jiān)督的化學(xué)模式方法能夠較好反映藥材內(nèi)在質(zhì)量,是近年來(lái)運(yùn)用較多的新方法[10]。本研究基于前期基礎(chǔ)[11,12],新建HPLC指紋圖譜,并結(jié)合聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析法等化學(xué)模式方法對(duì)不同產(chǎn)地前胡藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià);同時(shí),定量測(cè)定佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E四個(gè)香豆素類成分含量,明確不同產(chǎn)地前胡藥材的成分差異特征,為前胡藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型HPLC高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);AL204型萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);XPE105 型百萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)。

1.2 試劑

佛手苷內(nèi)酯(bergapten)(批號(hào):CHB201127)、白花前胡香豆精Ⅱ(peucedanocoumarin Ⅱ)(批號(hào):CHB210205)、白花前胡甲素(praeruptorin A)(批號(hào):CHB210115)、白花前胡乙素(praeruptorin B)(批號(hào):CHB201101)、白花前胡素E(praeruptorin E)(批號(hào):CHB201211)對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%,成都克洛瑪生物科技有限公司);甲醇(色譜純,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?批號(hào):MS1922-801);純凈水(華潤(rùn)怡寶市售純凈水,批號(hào):20221208);其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

前胡藥材總共有16批次,主要來(lái)自于湖南、貴州、重慶、安徽、湖北、云南等地,除市售樣品外,其余均為產(chǎn)地采集。所有樣品經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉浩副研究員鑒定為傘形科前胡屬白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根,具體信息見表1。

表1 前胡藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液

取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置于50 mL錐形瓶中,加入純甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取1 h,取出,放冷,稱定質(zhì)量,加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,過(guò)微孔濾膜(0.22 μm),即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液

精密稱定佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E對(duì)照品適量,加入純甲醇,溶解,配制成含白花前胡甲素1.838 mg/mL、白花前胡乙素0.432 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯0.012 mg/mL、白花前胡素E 0.616 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 空白對(duì)照溶液

取提取溶劑甲醇溶液,制備成空白對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

采用Agilent SB-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)色譜柱,以甲醇(A)-0.5%甲酸水(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0～35 min,30%→75%A;35～55 min,75%→78%A;55～70 min,78%→83%A;70 ～85 min,83%→100%A),流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)321 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積10 μL。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)1 g,精密稱定,按照供試品溶液的制備方法,在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以15號(hào)峰(白花前胡甲素)為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.011%～0.033%、0.050%～1.8%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)1 g,精密稱定,按照供試品溶液的制備方法平行制備六份,在2.2項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣,記錄色譜圖。以15號(hào)峰(白花前胡甲素)為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.036%～0.16%、0.56%～2.6%,均小于3.0%,表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)1 g,精密稱定,在2.2項(xiàng)色譜條件下分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以15號(hào)峰(白花前胡甲素)為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.040%～0.28%、0.070%～1.4%,均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

將16批前胡藥材按“2.1.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,在“2.2”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)行測(cè)定,得到HPLC色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》進(jìn)行分析,以S5的色譜圖為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后進(jìn)行色譜峰匹配,生成樣品疊加指紋圖譜(S1～S16)(見圖1)和對(duì)照?qǐng)D譜(見圖2)。以對(duì)照指紋圖譜為參照,進(jìn)行各樣品圖譜的相似度評(píng)價(jià),并采用對(duì)照品、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)等進(jìn)行色譜峰指認(rèn),結(jié)果見表2。結(jié)果表明,16批前胡樣品共標(biāo)定21個(gè)共有峰,共指認(rèn)9個(gè)成分,分別為7號(hào)峰(佛手苷內(nèi)酯)、13號(hào)峰(hyuganin D)、14號(hào)峰(白花前胡香豆精Ⅱ)、15號(hào)峰(白花前胡甲素)、16號(hào)峰(白花前胡香豆精 I)、17號(hào)峰(前胡香豆素J)、19號(hào)峰(白花前胡乙素)、20號(hào)峰(白花前胡素E)、21號(hào)峰(cis-3′,4′-diisovalerylkhellactone)。16批樣品相似度在0.966～0.999,各樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.989～0.999,相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見圖3,這表明不同產(chǎn)地間前胡藥材具有較高的相似性。然而,21個(gè)共有峰的峰面積RSD為23.9%～120.1%,說(shuō)明各產(chǎn)地間成分含量相差較大。

圖1 16批前胡HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 16 batches of Peucedani Radix

圖2 前胡對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Peucedani Radix

圖3 16批前胡指紋圖譜相似度熱圖Fig.3 Heat map of fingerprint similarity from 16 batches of Peucedani Radix

表2 白花前胡指紋圖譜共有峰指認(rèn)

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 HCA分析

采用多元統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA 14.1對(duì)將16批次前胡樣品的21個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行HCA分析,聚類樹狀圖見圖4。16批樣品聚為三類:S1～S3、S5～S6、S8、S10、S12聚為一類,產(chǎn)地為湖南華容、永州,湖北恩施,重慶奉節(jié),貴州遵義、大方(產(chǎn)地一類);S4、S7、S9、S11、S13～S14聚為一類,產(chǎn)地為安徽亳州、寧國(guó)、宣城(產(chǎn)地二類);S15、S16聚為一類,產(chǎn)地為云南(產(chǎn)地三類)。

圖4 16批前胡HCA聚類分析圖Fig.4 HCA analysis of 16 batches of Peucedani Radix

2.5.2 PCA分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)16批樣品21個(gè)共有峰進(jìn)行PCA分析,將共有峰標(biāo)準(zhǔn)化處理后,計(jì)算方差貢獻(xiàn)率。以特征值>1.0為標(biāo)準(zhǔn),提取出6個(gè)主成分,方差貢獻(xiàn)率依次為26.674%、18.599%、14.772%、11.785%、9.161%、5.222%,累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.213%,可代表21個(gè)共有峰的主要信息(見表3)。主成分因子載荷矩陣見表4可知,第一主成分主要代表了峰19、18、20、11、21,第二主成分主要代表了峰15、13,第三主成分主要代表了峰17、6,第四主成分主要代表了4、5,第五主成分主要代表了峰3、10,第六主成分主要代表了峰16。

表3 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 主成分因子載荷矩陣

2.5.3 PLS-DA分析

圖5 16批前胡樣品PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot of 16 batches of Peucedani Radix

圖6 16批前胡樣品21個(gè)共有峰的VIP值Fig.6 VIP value of 21 common peaks of 16 batches of Peucedani Radix

2.6 多指標(biāo)含量測(cè)定

2.6.1 專屬性試驗(yàn)

取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和空白對(duì)照溶液,在“2.2”項(xiàng)的條件下進(jìn)行分析,色譜圖見圖7。結(jié)果表明,佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于6 000,空白對(duì)照溶液無(wú)干擾。此方法專屬性較好。

圖7 前胡樣品(A)、混合對(duì)照品(B)以及空白對(duì)照(C)的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatograms of Peucedani Radix samples (A),mixed substance solution (B) and blank control (C)

2.6.2 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液2.5 mL,定容至5 mL,反復(fù)精密量取并稀釋,得到梯度濃度混合對(duì)照品。佛手柑內(nèi)酯梯度濃度分別為0.19、0.38、0.76、1.52、3.04、6.08、12.16 μg/mL;白花前胡甲素梯度濃度分別為28.72、57.44、114.88、229.75、459.50、919.00、1838.00 μg/mL;白花前胡乙素梯度濃度分別為6.75、13.50、27.00、54.00、108.00、216.00、432.00 μg/mL;白花前胡素E梯度濃度分別為9.63、19.25、38.50、77.00、154.00、308.00、616.00 μg/mL。精密吸取系列梯度濃度混合對(duì)照品溶液10 μL,按“2.2”項(xiàng)的條件注入液相色譜儀,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表5?？梢?在一定范圍內(nèi),各成分質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表5 前胡4種香豆素類成分線性回歸方程

2.6.3 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知待測(cè)成分含量的前胡樣品(S11)六份各0.50 g,精密稱定,加入與樣品含量相近的佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E對(duì)照品適量,按照“2.1.1”方法制備供試品溶液,在“2.2”色譜條件下,記錄峰面積,計(jì)算佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E加樣回收率,分別為99.28%、100.3%、101.2%、100.7%,RSD均小于3.0%。

2.6.4 樣品含量測(cè)定

按照“2.1.1”方法制備供試品溶液,按照“2.2”色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E,結(jié)果見表6。佛手柑內(nèi)酯含量0.016 7～0.131 9 mg/g,均值為0.041 2 mg/g,最高為云南昆明產(chǎn)地。白花前胡甲素6.069 6～16.225 5 mg/g,均值為10.028 8 mg/g,最高為重慶奉節(jié)。白花前胡乙素0.426 5～2.010 0 mg/g,均值為1.275 8 mg/g,最高為貴州遵義。白花前胡素E 1.340 7～3.115 5 mg/g,均值為2.271 0 mg/g,最高為湖南華容。按產(chǎn)地分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見圖8,產(chǎn)地三類(云南昆明、重慶奉節(jié))的佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素含量分別為0.095 4 mg/g和15.936 2 mg/g,遠(yuǎn)高于產(chǎn)地一類和產(chǎn)地二類,可作為區(qū)分產(chǎn)地三類的差異性成分。產(chǎn)地一類和二類的四個(gè)香豆素類成分含量總體差異不大。

圖8 產(chǎn)地類別中前胡藥材香豆素類成分含量Fig.8 Content of coumarins of Peucedani Radix in different producing areas

表6 前胡中四個(gè)香豆素類成分含量

3 討論與結(jié)論

為了優(yōu)化前胡HPLC指紋圖譜的色譜條件,本研究基于前期研究,對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、流速進(jìn)行優(yōu)化。采用全波長(zhǎng)掃描方法進(jìn)行分析,結(jié)果表明在波長(zhǎng)190～245 nm和290～340 nm有吸收,選擇321 nm檢測(cè)波長(zhǎng),其信息量大,響應(yīng)值較好,雜質(zhì)干擾少,確定以321 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)流動(dòng)相“乙腈-水”“甲醇-水”進(jìn)行考察,結(jié)果表明“甲醇-水”分離效果更好,0.5%甲酸水能得到更好峰形,因此確定“甲醇-0.5%甲酸水”為流動(dòng)相。此外,對(duì)流速1、0.8、0.5 mL/min進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)0.5 mL/min有更好的分離度,確定以0.5 mL/min作為此方法的流速。

本研究采用HPLC指紋圖譜對(duì)湖南、安徽、重慶、湖北、貴州、云南等產(chǎn)地樣品進(jìn)行分析,16批前胡藥材指紋圖譜具有較高相似度,共確定21個(gè)共有峰,共指認(rèn)了7個(gè)成分。在化學(xué)模式分析中,將16批樣品共分為三類,結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道,可分為:以安徽寧國(guó)、亳州等為主的道地產(chǎn)區(qū)前胡,以湖南、貴州、重慶等為主的前胡,以及高海拔云南產(chǎn)區(qū)的前胡。通過(guò)主成分和PLS-DA分析,6個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率86.213%,進(jìn)一步分析篩選出區(qū)分產(chǎn)地的8個(gè)共有峰,可作為產(chǎn)地的主要標(biāo)志性成分。高海拔云南產(chǎn)區(qū)前胡樣品的白花前胡甲素和佛手柑內(nèi)酯含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū),白花前胡乙素略高于其他產(chǎn)地,我們推測(cè),高海拔利于前胡藥材佛手柑內(nèi)酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素的積累。Yang等[15]認(rèn)為高海拔有利于白花前胡甲素和白花前乙素的生成與積累,Luo等[16]認(rèn)為海拔對(duì)白花前胡乙素含量的影響大于白花前胡甲素。雖然本研究與前人研究不盡相同,但可明確一點(diǎn),在高海拔環(huán)境下,更加有利于前胡藥材品質(zhì)的形成。

在多指標(biāo)成分含量測(cè)定分析中,共有9批前胡樣品白花前胡甲素符合《中國(guó)藥典》要求,占比56.25%,但沒有批次符合白花前胡乙素限量要求,最高者僅2.01 mg/g。Xu等[11]、Liu等[17]也均發(fā)現(xiàn),前胡藥材中白花前胡甲素更易達(dá)標(biāo),而白花前胡乙素不達(dá)標(biāo)現(xiàn)象較為常見。白花前胡為多年生一次開花植株,規(guī)模化種植致使改變?yōu)橐荒晟贩N,年限不足是前胡藥材品質(zhì)下降的重要原因。此外,白花前胡極易發(fā)生早薹現(xiàn)象[5],“火藥籽”(一年生種子)充斥市場(chǎng),長(zhǎng)期迭代選擇,前胡藥材品質(zhì)人為選擇性逐年下降。前胡藥材品質(zhì)的普遍性下降是否影響臨床療效,有待進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)報(bào)道[7],白花前胡甲素含量與白花前胡乙素存在某種程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系,本研究也發(fā)現(xiàn)存在這種趨勢(shì),但具體原因有待進(jìn)一步證實(shí)。市場(chǎng)上前胡藥材品質(zhì)低劣的原因除了生態(tài)環(huán)境、遺傳基因及人工干預(yù)外,還可能與現(xiàn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)存在較大關(guān)系?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中,市售前胡藥材合格率極低,特別是白花前胡乙素含量的達(dá)標(biāo)率,這種現(xiàn)狀已經(jīng)不符合前胡藥材臨床用藥及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在此背景下,Qiu等[18]探索采用白花前胡甲素與白花前胡乙素比值或和來(lái)綜合評(píng)價(jià)前胡藥材質(zhì)量,Liu等[19]、Xiao等[12]、Shi等[20]均對(duì)前胡藥材指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)研究,從不同角度對(duì)前胡藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià),并取得了較好預(yù)期。

本研究采用指紋圖譜、多指標(biāo)成分和化學(xué)模式分析三者相結(jié)合的方法對(duì)藥材品質(zhì)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià),對(duì)前胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的制訂具有重要的借鑒意義。然而,不足的是,本研究樣品的采集主要從市場(chǎng)、種植基地等途徑獲得,沒有詳細(xì)記錄種質(zhì)、生態(tài)環(huán)境、種植技術(shù)等信息,樣品一致性的局限可能對(duì)本研究存在一定影響。在后續(xù)研究中,應(yīng)加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境對(duì)前胡藥材品質(zhì)形成影響的研究,解決白花前胡早薹的核心問(wèn)題,加大藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的樣本量,制定符合市場(chǎng)預(yù)期、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。